巴戟天内生真菌的分离鉴定、活性筛选及次级代谢产物研究

摘要

巴戟天(Morinda officinalis How.)是四大南药之一，具有明显的地方区域特色。中药巴戟天常用茜草科藤本植物巴戟的干燥根，主要用于治疗男性阳痿遗精，女性宫冷不孕，月经不调，少腹冷痛，风湿痹痛，筋骨痿软等。迄今关于巴戟天的研究主要集中在药理作用、主要化学成分及炮制工艺方面，其内生真菌资源多样性及其次级代谢产物方面的研究仍然有较少报道。植物内生真菌在与宿主植物长期协同进化的过程中，既能产生与宿主相同或相似的次级代谢产物，也能产生其他有潜在药用价值的次生代谢产物，具有巨大的开发与研究价值。目前，在综合利用和保护天然药用植物资源的研究中，内生真菌及其次级代谢产物的研究一个新的研究热点。
　　本研究从巴戟天植物不同部位共分得28株内生真菌，通过小量的液体发酵培养，获得代谢产物粗提物，再对发酵产物进行薄层层析（TLC）、抗肿瘤活性和抗菌活性的测试，筛选获得代谢产物丰富、生物活性显著的2个目标菌株，暂命名为Alternaria sp. A744和Penicillium sp. A735。细胞毒活性显示，当粗提物浓度为10μg/mL时，这2株菌对人乳腺癌细胞（MCF-7）、人肝癌细胞（HepG-2）、人肺癌细胞（NCI-H460）、人神经癌细胞（SF-268）的抑制率分别为95.53％、86.14%、92.02%、95.50%和85.70%、91.44%、93.08%、86.86%，阳性对照顺铂，在浓度为10μg/mL时抑制率为65.55%、85.64%、86.70%、82.81%。抗细菌结果显示，Alternaria sp. A744和Penicillium sp. A735的代谢产物粗提物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用，其MIC分别为0.39、1.56 mg/mL和0.78、0.39 mg/mL；抗真菌结果显示Alternaria sp. A744对白色念珠菌、黑曲霉、黄曲霉和绿色木霉的抑制效果比较显著，其抑菌圈大小分别为9、11、10和10mm。采用正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶色谱柱层析、高效液相（HPLC）色谱分离等分离手段对这2株菌株菌株的次级代谢产物进行分离纯化；采用波谱分析技术（1H-NMR、13C-NMR、COSY、HMQC、HMBC等）结合 MS、IR、UV、CD等分析方法对分离得到的单体化合物进行结构鉴定，最终从菌株Alternaria sp. A744和Penicillium sp. A735中共分离鉴定单体化合物23个，其中从菌株Alternaria sp. A744中分离得到16个单体化合物，其中2个为新化合物；从菌株Penicillium sp. A735中分离到7个已知的化合物。对化合物1-16进行了细胞毒活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定，新化合物均未显示明显的细胞毒和α-葡萄糖苷酶抑制活性，已知化合物9、11和12对肿瘤细胞株 MCF-7、HepG-2、NCl-H460、SF-268具有较好的抑制活性，化合物9对以上肿瘤细胞株的IC50值分别为35.73、52.38、43.31、49.04μM，化合物11对以上肿瘤细胞株的IC50值分别为3.73、5.30、5.47、6.57μM，化合物12对以上肿瘤细胞株的IC50值分别为1.91、5.63、9.67、4.25?M，而阳性对照顺铂的IC50值分别为3.09、1.39、2.43和2.37μM。化合物4、5、9、10、12、13、14表现出明显的?-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值分别为34.88、97.85、139.63、70.44、10.25、173.32、97.65μM，而阳性对照阿卡波糖IC50值为468.21μM。

目录

声明

第1章 综述

1.1 植物内生真菌次级代谢产物的化学成分研究概况

1.1.1 聚酮类化合物

1.1.2 生物碱类化合物

1.1.3 萜类和甾类化合物

1.1.4 其他化合物

1.2 植物内生真菌次级代谢产物的生物活性多样性研究概况

1.2.1抗肿瘤活性

1.2.2 抗菌活性

1.2.3 抗氧化活性

1.2.4 抗炎活性

1.2.5 杀虫活性

1.2.5 其他活性

1.3 研究目的与意义

第2章 巴戟天内生真菌菌株的分离、鉴定与活性筛选

2.1 实验部分

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要仪器与试剂

2.1.3 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 内生真菌分离鉴定结果

2.2.2 粗提物薄层层析（TLC）检测结果

2.2.3 粗提物细胞毒活性测定结果

2.2.4 粗提物抗菌测定结果

2.3 讨论

第3章 Alternaria sp. A744次级代谢产物及其生物活性研究

3.1 实验部分

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要仪器与试剂

3.1.3 Alternaria sp. A744的发酵与培养

3.1.4 Alternaria sp. A744的提取与分离

3.2 次级代谢产物的结构鉴定

3.2.1材料与方法

3.2.2 单体化合物的结构解析新化合物1

3.3 单体化合物的活性测定

3.3.1 材料与方法

3.3.2 细胞毒活性及酶活性测定结果

3.4 讨论

第4章 Penicillium sp. A735次级代谢产物及其生物活性的研究

4.1 实验部分

4.1.1 实验材料

4.1.2 主要仪器与试剂

4.1.3 Penicillium sp. A735的发酵与培养

4.1.4 Penicillium sp. A735的提取与分离

4.2 次级代谢产物的结构鉴定

4.2.1实验材料与方法

4.2.2 单体化合物的结构解析

4.3 讨论

总结

参考文献

致谢

附录A 攻读学位期间发表的论文目录

附录B 新化合物谱图数据