广藿香内生真菌的活性筛选及露湿漆斑菌的次级代谢产物研究

摘要

植物内生真菌（endophytic fungi）是指全部或部分生活史寄居在健康植物的细胞内或者各类组织中的真菌，它们的存在不会给植物带来明显的病害症状。一般内生真菌与宿主本身是互利互惠关系，而且内生菌能够产生与宿主植物相同或相近的具有生物活性的次级代谢产物。据报道，植物内生真菌次级代谢产物具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒等多种生物活性，因此植物内生真菌次级代谢产物成为新型药物开发的物质来源。本论文从广东药学院大学城校区采集的广藿香植株中分离得到38株内生真菌，通过对各菌株发酵液粗提物化合物丰富程度、抗菌活性实验、细胞毒活性实验等指标进行筛选，菌株露湿漆斑菌（Myrothecium roridum，A553）发酵液粗提物能明显抑制肝癌细胞HepG2、人神经癌细胞SF-268、非小细胞肺癌细胞NCI-H460等细胞株活性，样品浓度在100μg/mL时生长抑制率分别为94.3％，88.7%和83.8%。通过对露湿漆斑菌（Myrothecium roridum）菌株进行大批量发酵培养、代谢产物分离提取等，以期筛选出具有明显细胞毒活性化合物。
　　目的：筛选出广藿香内生真菌中高活性菌株，研究广藿香内生真菌露湿漆斑菌（myrothecium roridum）次级代谢产物活性物质。
　　方法：主要考察内生真菌发酵液粗提物细胞毒活性、抗菌活性等指标进行筛选优质菌株；对优质菌株发酵液和菌丝体提取液采用常规正向硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、C18反相层析柱、高效液相色谱柱、薄层层析制备板和重结晶等方法分离纯化化合物，并通过理化常数测定及波谱数据分析等手段（1H-NMR、13C-NMR、EI-MS、HR-ESI-MS、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等）对分离纯化的化合物进行结构鉴定；以神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、肝癌细胞HePG-2为供试细胞株，采用SRB染色法对化合物进行体外细胞毒活性研究；以白色念珠菌作为供试菌株，采用滤纸片法对所得化合物进行体外抗菌活性研究。
　　结果：从分离得到的38株内生真菌中筛选出13株高活性菌株；从发酵液和菌丝体中共分离到20个化合物，经波谱数据分析和样品对照鉴定出其中14个化合物，分别为：羟基酪醇(Hydroxytyrosol, MR1)，2-羟基-6-（2-羟基丙基）苯甲酸(2-hydroxy-6-(2-hydroxypropyl)benzoic acid,MR2)，1,3-二-O-[2',2'-二-（对-亚苯基）异亚丙基]甘油(MR3)，杆孢菌素E异构体(MR4)，真菌毒素mytoxin B(MR5),对羟基安息香醛(4-hydroxybenzaldehyde,MR6)，nepethalate A(MR7)，16-羰基杆孢菌素E(MR8)，啤酒甾醇(MR9)，尿嘧啶核苷(uridine, MR10)，吡咯烷酮(MR12)，大黄酚(MR13)，5-羟甲基糠醛(MR14)，麦角甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(MR15)。
　　结论：34.2%的菌株发酵液粗提物具有显著生物活性。化合物MR1、MR2、MR3、MR6、MR7、MR8、MR12-MR15为首次从该菌株次级代谢产物中分离得到，化合物 MR8为新化合物；化合物MR3、MR4、MR5、MR8、MR10对神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、非小细胞肺癌细胞株NCI-H460和肝癌细胞HePG-2均表现出较好的活性。MR9对乳腺癌细胞MCF-7、非小细胞肺癌细胞株NCI-H460和肝癌细胞HePG-2具有较好的抑制作用。化合物MR4对白色念珠菌具有一定的抗菌活性。其中新化合物MR8活性稍低于已知化合物MR4的生物活性。

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引言

植物内生真菌次级代谢产物研究进展

1.1抗肿瘤活性化合物

1.2抗菌活性物质

1.3抗病毒活性物质

1.4抗疟原虫活性物质

1.5其他生物活性

第二章 内生真菌的菌株分离和筛选

2.1 材料

2.2 试剂

2.3 仪器

2.4 方法

2.5 结果与分析

2.6 小结

第三章 露湿漆斑菌Myrothecium roridum代谢产物研究

3.1 材料

3.2试剂

3.3 仪器

3.4 发酵培养与分离提取

3.5 化合物结构鉴定

第四章 单体化合物细胞毒活性与抗菌活性测定

4.1材料

4.2 试剂

4.3 仪器

4.4方法

4.5结果与分析

第五章 总结和讨论

参考文献

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致谢

附图