荧光纳米标记与编码技术用于几种重要病原菌检测的研究

摘要

病原菌检测涉及到食品安全检验、疾病诊断、环境监测以及反生物恐怖等领域，与人类健康、社会安定和国家安全息息相关。传统的病原菌检测方法灵敏度低、费时耗力。各种建立在现代分子生物学、免疫学技术和现代分析仪器基础上的病原菌快速检测方法，为提高检测的灵敏度和可靠性做出了重要贡献，然而这些方法仍然存在各种局限性。功能化纳米材料具有许多普通材料无可比拟的优良特性，在病原菌的快速、灵敏检测上显示出广阔的应用前景。其中，硅壳荧光纳米材料是荧光最强的纳米材料之一，基于硅壳荧光纳米材料建立的荧光纳米标记技术比传统荧光标记技术具有更高的灵敏度和更好的光稳定性，为样品中少量病原菌的超灵敏检测提供了新的契机。本论文瞄准病原菌检测这一研究方向，在对各种病原菌检测方法进行简要综述的基础上，以荧光纳米标记与编码技术用于结核杆菌、大肠杆菌O157：H7等重要病原菌的快速、灵敏和多元检测为主线，主要开展了以下几个方面的研究工作： 一、基于硅壳荧光纳米颗粒的间接免疫荧光显微镜法(FNP—IIFM)用于结核杆菌快速检测的研究。 将荧光纳米标记技术与免疫荧光分析法相结合，发展了一种新型的基于硅壳荧光纳米颗粒的间接免疫荧光显微镜法用于结核杆菌的快速检测。通过采用兔抗结核杆菌抗体对目标结核杆菌进行特异性识别后，以修饰了葡萄球菌蛋白A的联吡啶钌(RuBpy)硅壳荧光纳米颗粒作为信号指示，利用葡萄球菌蛋白A与抗体之间的特异性结合，实现对结核杆菌的间接标记，通过荧光显微镜对标记的结核杆菌进行荧光成像检测。结果表明，该方法可以成功应用于对缓冲液体系、混合细菌样品和掺杂痰液样品中结核杆菌的检测，整个检测步骤包括样品预处理可在4h内完成；并且，采用硅壳荧光纳米颗粒作为荧光标记物用于结核杆菌的检测比传统荧光染料具有更高的信号强度与更好的光稳定性，有望应用于临床痰液标本中结核杆菌的快速检测。 二、基于硅壳荧光纳米颗粒和SYBR GreenⅠ的双色流式细胞术(FSiNP@SG—FCM)用于结核杆菌检测的研究。 将基于硅壳荧光纳米颗粒的免疫荧光分析法与流式细胞术相结合，发展了一种新型的基于功能化RuBpy硅壳荧光纳米颗粒和SYBR GreenⅠ的改良双色流式细胞术用于结核杆菌的检测。采用RuBpy硅壳纳米颗粒标记的抗体对样品中目标结核杆菌进行免疫荧光染色后，以核酸染料SYBR GreenⅠ对样品中细菌的核酸进行染色，从而将细菌与样品中的碎片杂质区分，通过多参数流式细胞术对样品中双染色的结核杆菌进行测定与分析。将该方法用于对缓冲液体系和掺杂尿液样品中的结核杆菌进行检测。结果表明，该方法显著地减小了由纳米颗粒团聚以及纳米颗粒对杂质碎片的非特异性吸附所引起的假阳性信号，对缓冲液体系和掺杂尿液样品的检测下限分别为3.5×103和3.0×104 cells/ml结核杆菌，并且比基于FITC标记的传统流式细胞术具有更高的灵敏度，整个检测步骤包括样品预处理可在2 h内完成，有望应用于临床尿液标本中结核杆菌的快速检测。 三、多色光学编码硅壳荧光纳米材料的制备研究。 基于荧光共振能量转移(FRET)与反相微乳液法硅壳荧光纳米材料制备技术，发展了一种简易的多色光学编码硅壳荧光纳米材料的制备新方法。采用两种FRET供受体荧光染料按不同的比例与载体材料人免疫球蛋白(或多聚赖氨酸)作用制备荧光编码的载体材料，以荧光编码的载体材料为内核材料，利用氨水催化硅烷化试剂在反相微乳液中水解包裹内核材料制备成一系列多色光学编码硅壳纳米材料。对两类光学编码硅壳纳米材料的形貌和荧光性质进行考察，结果表明，以人免疫球蛋白为载体材料制备的光学编码硅壳纳米材料为球形，而以多聚赖氨酸作为载体材料制备的光学编码硅壳纳米材料为棒状，通过改变供受体染料的标记比，可以获得一系列具有不同荧光发射光谱性质的纳米球或纳米棒，由于荧光共振能量转移效应，这些材料能以同一波长的光激发出不同颜色的荧光，而且荧光强、性质稳定、制备方法简便易行，在病原菌多元检测、多基因表达分析、蛋白质多元分析、多通道生物学测定、医学诊断学等方面都有广阔的应用前景。 四、多色光学编码硅壳荧光纳米棒用于病原菌DNA片断多元检测的研究。 基于多色光学编码硅壳荧光纳米棒建立多元荧光标记技术并与三明治固相核酸杂交检测技术相结合，发展了一种可用于对大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生性李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种常见食源性病原菌DNA片断同时检测的多元分析方法。针对三种目标菌编码特异性毒素的基因序列合成目标DNA片断以及特异性的捕获探针和信号探针，在微珠上分别修饰三种捕获探针，对三种细菌目标DNA片断进行杂交捕获后，以分别修饰了三种信号探针的三种不同颜色的光学编码硅壳纳米棒作为信号指示对目标DNA进行杂交检测。利用该方法对单一目标细菌DNA片断检测性能的考察表明，方法的检测下限为0.3 nM DNA、线性范围为0.3—1.9 nM DNA、可在2 h内完成分析；在此基础上进一步利用三种不同颜色的光学编码硅壳纳米棒作为信号指示与三明治核酸杂交相结合成功地实现了对大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生性李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种食源性病原菌DNA片断的同时检测，极大地提高了检测的效率。该方法可望用于病原菌基因的多元分析中。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：本文所用英文缩略词表

声明

第1章绪论

1.1病原菌概况

1.2传统的病原菌检测方法

1.3现有的病原菌快速检测方法

1.3.1免疫学方法

1.3.2分子生物学方法

1.3.3用于病原菌检测的生物传感器

1.3.4流式细胞术

1.4功能化纳米材料在病原菌检测中的应用

1.4.1金纳米颗粒在病原菌检测中的应用

1.4.2量子点在病原菌检测中的应用

1.4.3磁性纳米材料在病原菌检测中的应用

1.4.4硅壳荧光纳米颗粒在病原菌检测中的应用

1.5本论文构思

第2章基于硅壳荧光纳米颗粒的间接免疫荧光显微镜法(FNP-IIFM)用于结核杆菌快速检测的研究

2.1前言

2.2实验部分

2.2.1试剂和仪器

2.2.2细菌

2.2.3 RuBpy硅壳荧光纳米颗粒的制备与性质表征

2.2.4 RuBpy硅壳纳米颗粒的生物修饰

2.2.5间接免疫荧光显微镜法检测结核杆菌

2.2.6混合细菌样品的制备

2.2.7掺杂痰液样品的制备

2.2.8显微镜成像

2.3结果与讨论

2.3.1 RuBpy硅壳荧光纳米颗粒的制备与性质表征

2.3.2 SPA在纳米颗粒表面的共价修饰

2.3.3 FNP-IIFM法对结核杆菌纯培养物的检测

2.3.4 FNP-IIFM法对混合细菌样品中结核杆菌的检测

2.3.5 FNP-IIFM法对掺杂痰液样品中结核杆菌的检测

2.4小结

第3章基于硅壳荧光纳米颗粒和SYBR Green I的双色流式细胞术(FSiNP@SG-FCM)用于结核杆菌检测的研究

3.1前言

3.2实验部分

3.2.1试剂和仪器

3.2.2细菌

3.2.3 RuBpy硅壳纳米颗粒的生物修饰

3.2.4 FSiNP@SG-FCM法对结核杆菌的检测

3.2.5掺杂尿液样品的制备

3.2.6流式细胞术分析

3.3结果与讨论

3.3.1功能化RuBpy硅壳纳米颗粒与SYBR Green I染色的细菌的荧光光谱

3.3.2采用FSiNP@SG-FCM法检测结核杆菌的原理

3.3.3采用FSiNP@SG-FCM法检测结核杆菌的可行性研究

3.3.4 FSiNP@SG-FCM法对结核杆菌纯培养物检测的灵敏度

3.3.5 FSiNP@SG-FCM法对掺杂尿液样品中结核杆菌的检测

3.4小结

第4章多色光学编码硅壳荧光纳米材料的制备研究

4.1前言

4.2实验部分

4.2.1试剂和仪器

4.2.2光学编码硅壳纳米材料的制备

4.2.3多色光学编码硅壳纳米材料的表征

4.3结果与讨论

4.3.1多色光学编码硅壳纳米材料的制备原理

4.3.2染料和载体的选择

4.3.3基于IgG载体材料制备的多色光学编码硅壳纳米材料的性质研究

4.3.4基于多聚赖氨酸载体材料制备的多色光学编码硅壳纳米材料的性质研究

4.3.5两种多色光学编码硅壳荧光纳米材料的性质比较

4.4小结

第5章多色光学编码硅壳荧光纳米棒用于病原菌DNA片断多元检测的研究

5.1前言

5.2实验部分

5.2.1试剂及仪器

5.2.2多色光学编码硅壳荧光纳米棒的合成

5.2.3寡核苷酸探针与目标DNA的设计与合成

5.2.4寡核苷酸探针在多色光学编码硅壳纳米棒与微珠表面的修饰

5.2.5对单一目标菌DNA片段的检测

5.2.6对多种目标菌DNA片段的同时检测

5.3结果与讨论

5.3.1检测原理

5.3.2寡核苷酸探针在纳米颗粒与微珠表面的修饰效果

5.3.3采用三明治固相核酸杂交与多色光学编码硅壳纳米棒对单一目标菌DNA片段进行检测

5.3.4采用多色光学编码硅壳纳米棒与三明治固相核酸杂交相结合对多种目标菌DNA片段的同时检测

5.4小结

结论

参考文献

附录A 攻读博士学位期间发所发表的学术论文及专利

致谢