硅基荧光纳米粒子标记食源性病原菌检测方法研究

摘要

目前，已报道的食源性致病菌检测方法多种多样，但各有其优缺点。本文将纳米探针技术与荧光分析方法结合应用于免疫分析及DNA杂交分析，建立了新型分析方法体系，实现了对目标物的超微量检测。
　　 本文首先制备Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2荧光纳米颗粒，并以其为标记物，初步应用于人IgG的检测。在最佳实验条件下，荧光强度和人IgG浓度在1～100 ng/mL范围内成线性，检出限0.3 ng/mL。
　　 其次，论文对Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2纳米粒子进行亲和素修饰，与生物素化的沙门氏菌序列特异寡核苷酸探针结合构建荧光纳米生物探针，以其为显示探针与沙门氏菌序列特异寡核苷酸捕获探针一起通过DNA杂交捕获目标DNA，通过检测显示探针荧光强度定量目标DNA含量。结果表明，荧光强度和目标DNA浓度在10～1000 fmol/L范围内呈线性关系，检出限3 fmol/L。采用同样的原理构建了金黄色葡萄球菌目标DNA的新型分析方法，荧光强度与目标DNA浓度在3～1000 fmol/L范围内成线性，检出限为1fmol/L。
　　 再次，论文基于分子信标识别和荧光纳米粒子标记技术，建立了均相体系中李斯特菌目标DNA的检测新方法。以FITC-IgG@SiO2纳米粒子和纳米金分别标记李斯特菌序列特异性分子信标探针5’端和3’端，成功构建了李斯特菌序列特异性分子信标荧光纳米探针，建立了均相体系中李斯特菌目标DNA的新型分析方法。在实验优化条件下，荧光强度与目标DNA浓度在1～200 nmol/L浓度范围内呈线性关系，检出限0.3 nmol/L。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 引言

1.1 纳米材料研究进展

1.1.1 生物分析用纳米粒子的发展

1.1.2 二氧化硅包覆荧光染料纳米颗粒在生物分析中的应用

1.2 食源性致病菌检测方法研究进展

1.3 研究课题的立题意义与研究内容

1.3.1 本课题的立题意义

1.3.2 本课题的研究内容

2.实验材料与方法

2.1 材料与主要试剂

2.2 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 荧光纳米颗粒标记人免疫球蛋白G免疫分析方法

2.3.2 荧光纳米颗粒标记沙门氏菌与金黄色葡萄球菌DNA杂交分析方法

2.3.3 荧光纳米探针修饰分子信标-李斯特菌DNA均相分析方法研究

3 结果与讨论

3.1 荧光纳米颗粒标记人免疫球蛋白G免疫分析方法研究

3.1.1 联吡啶钉掺杂二氧化硅纳米粒子的制备与表征

3.1.2 联吡啶钉掺杂二氧化硅纳米粒子光稳定性研究

3.1.3 联吡啶钉的用量对纳米颗粒荧光强度的影响

3.1.4 联吡啶钉掺杂二氧化硅纳米粒子标记抗体

3.1.5 纳米粒子表面结合羊抗人IgG量的优化

3.1.6 抗体-荧光纳米颗粒复合物浓度优化

3.1.7 分析性能

3.1.8 分析应用

3.2 荧光纳米颗粒标记-沙门氏菌DNA杂交分析方法研究

3.2.1 联吡啶钌掺杂二氧化硅纳米粒子的制备与表征

3.2.2 酶标板包被亲和素

3.2.3 纳米粒子结合亲和素量的优化分析

3.2.4 纳米粒子结合生物素化的显示探针DNA量的优化

3.2.5 纳米粒子-显示探针复合物的浓度优化

3.2.6 分析性能

3.2.7 特异性分析

3.2.8 沙门氏菌DNA的提取与检测

3.3 荧光纳米颗粒标记-金黄色葡萄球菌DNA杂交分析方法研究

3.3.1 酶标板包被亲和素优化分析

3.3.2 纳米粒子结合亲和素量的优化分析

3.3.3 纳米粒子结合生物素化的显示探针DNA量的优化

3.3.4 纳米粒子-显示探针复合物的浓度优化

3.3.5 分析性能

3.3.6 特异性分析

3.3.7 金黄色葡萄球菌DNA的提取与检测

3.4 荧光纳米探针修饰分子信标-李斯特菌DNA均相分析方法研究

3.4.1 纳米金的表征

3.4.2 FITC-IgG掺杂的SiO2 纳米材料的表征

3.4.3 FITC-IgG掺杂的SiO2 纳米材料光稳定性研究

3.4.4 制备溶液中FITC—IgG浓度的优化分析

3.4.5 纳米粒子结合亲和素量的优化分析

3.4.6 分子信标与其目标DNA的响应特性优化分析

3.4.7 DNA杂交的温度优化分析

3.4.8 分析性能

3.4.9 特异性分析

3.4.10 李斯特菌DNA的提取与检测

4 结论与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文