酵母燃料乙醇生产相关基因SPT15基因工程改造研究

摘要

化石能源是当今能源结构的主体,却是一类非常宝贵的不可再生资源。面对化石能源日益短缺及其燃烧产生的环境污染问题日益严重的现状,人们开始寻找清洁可持续利用的替代能源。因此,开发和利用生物质能源己成为一种战略选择。生物质能源产业中,目前规模方面发展最快的是燃料乙醇,但成本高昂是制约微生物发酵生产乙醇工业的瓶颈。尤其是对于同步糖化发酵法生产乙醇,糖化和发酵时的最适温度不协调以及乙醇的抑制作用是急待解决的问题。研究开发出适用于同步糖化发酵技术所需高耐受性酵母菌株,就可以提高燃料乙醇的生产效率、降低成本。因此,本论文针对与酵母中能耐受高浓度糖及高浓度乙醇的基因——转录因子SPT15进行基因工程改造,期望能获得高耐受性酵母菌株。对SPT15进行了不同长度片段的随机突变,并将产物连接到含有半乳糖启动子的酵母穿梭载体质粒PYES2(多拷贝质粒)和PGAL1-Ycplac22(单拷贝质粒)中,使突变基因能被诱导过量表达。随机突变采用在标准PCR反应体系中加入Mn2+的方式,通过对不同片段长度的SPT15基因随机突变的体系进行的系统研究,我们发现大于500bp长度的DNA随着Mn2+浓度的提高,突变率迅速上升,而小于250 bp短片段的DNA对Mn2+浓度不特别敏感,从而进一步确定了对1000 bp长度以内不同长度片断单突变或多突变所适合的Mn2+浓度。同时,在建立突变体库的过程中,对大肠杆菌电转化条件进行了摸索,确定了电转化的最佳方式。本文构建的SPT15突变体库为进一步筛选高耐受酵母菌创造了条件,为酵母基因工程改造提供了有价值的实验经验。

目录

文摘

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插图索引

附表索引

缩略词

第1章 绪论

1.1 生物能源现状及生产燃料乙醇酵母基因工程菌的研究

1.1.1 生物能源现状

1.1.2 燃料乙醇开发的发展状况

1.2 SPT15基因

1.3 方法背景

1.4 本文构想

第2章 构建含有SPT15基因的PYES2质粒

2.1 材料

2.1.1 微生物菌种

2.1.2 质粒来源

2.1.3 工具酶和试剂

2.1.4 仪器

2.1.5 试剂配制

2.1.6 引物

2.2 方法

2.2.1 PCR扩增目的基因SPT15

2.2.2 PCR扩增目的片段的纯化

2.2.3 SPT15基因克隆载体的构建

2.2.4 重组载体的鉴定

2.3 结果

2.3.1 PCR扩增目的基因

2.3.2 测序质粒PYES2-SPT15的鉴定结果

2.3.3 核苷酸序列测定及同源性分析

2.4 讨论

2.4.1 PCR特异性反应

2.4.2 重组质粒的筛选

2.4.3 菌落PCR及LETR法各自鉴定阳性克隆的优势

2.5 小结

第3章 构建含有SPT15基因、半乳糖启动子片段的Ycplac22质粒

3.1 材料

3.1.1 质粒

3.1.2 引物

3.2 方法

3.2.1 PCR扩增目的基因SPT15

3.2.2 表达重组质粒Ycplac22-SPT15的构建

3.2.3 重组载体的鉴定

3.2.4 PCR扩增半乳糖启动子

3.2.5 PCR扩增半乳糖启动子的纯化

3.2.6 PGAL1-Ycplac22-SPT15基因克隆载体的构建

3.2.7 重组载体的鉴定

3.3 结果

3.3.1 PCR扩增目的基因SPT15

3.3.2 测序质粒Ycplac22-SPT15的鉴定结果

3.3.3 核苷酸序列测定及同源性分析

3.3.4 PCR扩增半乳糖启动子

3.3.5 测序质粒PGAL1-Ycplac22-SPT15的鉴定结果

3.3.6 核苷酸序列测定及同源性分析

3.4 小结

第4章 Mn2+对不同长度DNA片段随机突变影响

4.1 材料

4.1.1 PCR扩增引物

4.1.2 PCR测序引物

4.2 方法

4.2.1 提取提取PYES2-SPT15质粒

4.2.2 用融合PCR方法扩增无突变的SPT15目的基因

4.2.3 用融合PCR方法扩增223 bp突变的spt15目的基因

4.2.4 用融合PCR方法扩增500 bp突变的spt15目的基因

4.2.5 Mn2+对723 bp DNA片段随机突变影响

4.3 结果

4.3.1 PCR扩增目的基因

4.3.2 测序质粒PYES2-spt15的鉴定结果

4.3.3 核苷酸序列测定及同源性分析

4.3.4 突变序列的测定总结

4.4 讨论

4.4.1 锰离子对基因随机突变的影响

4.4.2 融合PCR

4.5 小结

第5章 大肠杆菌高转化效率的探索

5.1 溶液配制

5.2 热激转化大肠杆菌的效率探索

5.2.1 大肠杆菌的制备

5.2.2 大肠杆菌的转化

5.3 电转化大肠杆菌的效率探索

5.3.1 仪器参数的研究

5.3.2 质粒含量对电转化效率的影响

5.4 结果与讨论

5.4.1 热激转化的分析

5.4.2 电转化实验结果及分析

5.4.3 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢