电化学生物传感技术用于单碱基突变与蛋白质的检测

摘要

高效快捷的核酸与蛋白质检测对于环境监测、食品工程、生物医学及临床疾病的诊断有着非常重要的意义。电化学生物传感技术由于灵敏度高、选择性好、所需仪器简单、成本低等优点,是当前科学研究中普遍使用的检测方法之一。在核酸和蛋白质检测研究中,利用核酸分子杂交、免疫分析、小分子与蛋白质间的特异性亲和作用提高了检测的选择性。同时用电化学活性物质和纳米材料作为检测标记物,可大大提高检测灵敏度。本文基于此,发展了几种检测核酸和蛋白质的化学生物传感技术:
　　 (1)建立了一种基于S1核酸酶切割反应,二茂铁作为电活性标记物的电化学生物传感体系,用于单碱基突变的检测(第2章)。首先,对检测探针3’端进行二茂铁标记,并分别与正常型和突变型目标链杂交,形成3’末端不完全互补序列(突出末端)和完全互补序列。接着应用S1酶对双链突出末端的切割作用,使和正常型目标链杂交的检测链上的二茂铁游离,而和突变型目标链杂交的检测链依然保持二茂铁的标记。最后检测链和组装在金电极表面的捕获探针杂交,从电化学信号的强弱实现对单碱基突变的检测。
　　 (2)进一步利用核酸酶(核酸外切酶Ⅰ)的切割作用和二茂铁作为电活性物质的信号转换作用,建立一种核酸末端保护分析方法,用于研究小分子和蛋白质的特异性结合作用,进而对相关蛋白质实现有效检测(第3章)。首先,在检测核酸链5’端标记二茂铁,另3’端标记生物素。接着,当链霉亲和素存在时,检测核酸链和链霉亲和素特异性结合,由于空间位阻较大,加入的核酸外切酶不能对该检测链进行切割。最后,检测链在电极上被捕获产生电化学信号。
　　 (3)构建了一种基于磷脂修饰多壁碳纳米管MWNTs(PIdMWNTs)作为信号调控物质的电化学免疫传感技术(第4章)。首先,通过非共价键作用在MWNTs表面修饰磷脂分子,用磷脂分子末端的氨基共价交联肿瘤标志物前列腺特异性抗原(PSA)的单克隆抗体(MAb),得到MWNTs/MAb复合物。接着,通过磁分离免疫夹心反应收集该PL/MWNTs复合物。最后,沉积到十八烷基硫醇绝缘膜修饰的电极表面的MWNTs改变了电极表面的性质,产生了电化学信号。技术实现了对PSA的高灵敏、高特异性检测,响应动态范围为5 pg/mL到100 ng/mL,检测限为3 pg/mL,并测定了实际样品。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪论

1.1 电化学生物传感器的工作原理

1.2 电化学生物传感器的分类

1.2.1 电化学酶传感器

1.2.2 电化学免疫传感器

1.2.3 电化学DNA传感器

1.3 电化学生物传感器的检测方法

1.3.1 伏安法

1.3.2 电化学交流阻抗法

1.3.3 计时电位法

1.4 电化学生物传感器灵敏度的提高

1.4.1 碳纳米管(CNTs)的性质

1.4.2 基于碳纳米管信号增强的电化学生物传感器

1.5 本研究工作的构想

第2章 基于酶切反应的电化学单碱基突变检测

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂及仪器

2.2.2 探针的设计及反应条件的选择

2.2.3 金电极的处理及捕获探针在金电极上的组装

2.2.4 二茂铁修饰氨基标记的核酸链

2.2.5 目标链杂交反应

2.2.6 酶切反应

2.2.7 捕获杂交反应及电化学检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 基于酶切反应的电化学单碱基突变检测方法的原理

2.3.2 传感模型的电流响应

2.3.3 传感模型的交流阻抗

2.3.4 传感模型在不同扫描速率下的电化学特性

2.3.5 检测探针的工作曲线

2.4 小结

第3章 核酸末端保护电化学分析方法检测与小分子结合的蛋白质

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 硫辛酸和二茂铁甲酸分别标记捕获探针和检测探针

3.2.3 捕获探针在金电极上的组装

3.2.4 核酸末端保护分析反应

3.2.5 固相表面杂交及电化学检测

3.3 结果与讨论

3.3.1 核酸末端保护电化学分析方法检测与小分子结合的蛋白质的原理19

3.3.2 传感器的电化学响应

3.3.3 传感体系的交流阻抗特性

3.3.4 毛细管电泳和凝胶电泳分析

3.3.5 传感体系在不同扫描速率下的电化学行为

3.3.6 反应条件的优化

3.3.7 核酸末端保护分析的特异性

3.3.8 工作曲线

3.4 小结

第4章 磷脂修饰碳纳米管信号调控电化学免疫分析

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂与仪器

4.2.2 电极表面的处理及修饰

4.2.3 磷脂非共价修饰MWNTs

4.2.4 MWNTs/Mab?复合物的制备

4.2.5 MB/MAb?复合物的制备

4.2.6 免疫分析及电化学检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 磷脂修饰碳纳米管信号调控磁分离电化学免疫分析的基本原理

4.3.2 免疫传感技术分析的电化学响应

4.3.3 交流阻抗谱法表征不同阶段电极表面情况

4.3.4 电极表面经过不同处理后的电化学响应

4.3.5 SEM对不同处理阶段电极表面形貌的表征

4.3.6 均相免疫复合物的TEM表征

4.3.7 DMF处理免疫复合物的表征

4.3.8 工作曲线

4.3.9 免疫分析的干扰实验

4.3.10 实际样品检测

4.4 小结

结论

参考文献

致谢