微流控芯片用于C反应蛋白核酸适体的筛选研究

摘要

核酸适体(aptamers)是指可与目标分子特异性结合的寡聚核苷酸亲和配体-即单链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。核酸适体具有许多优良特性，在疾病检测、药物研发、临床治疗及基因表达调控机理研究等多个领域有着良好的应用前景。目前，限制核酸适体应用的瓶颈仍是核酸适体的高效筛选。传统SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指数富集式配体系统进化)技术一般需要8～20轮甚至30轮的筛选，耗时、费力。因此迫切需要发展新的快速高效的核酸适体的筛选方法。本工作致力于建立微流控SELEX筛选平台，发展核酸适体的快速高效的筛选方法，以C反应蛋白为例进行核酸适体的筛选并考察其亲和力、特异性，研究内容包括：
　　为了缩短整个筛选流程的时间，本工作借助微流控芯片的高分离效率，设计了一种操作简便，无需外加分离装置的微流控芯片。芯片由四条直通道组成，每条通道中间有一收缩段，能够截留一定尺寸的微珠。由于芯片的制作需要较好的、稳定的刻蚀条件及在此条件下的刻蚀速度，因此本文对刻蚀液成分、刻蚀温度、刻蚀速度进行了优化和测量。在最优的刻蚀条件下，通过控制刻蚀时间获得不同深度的通道，经两次刻蚀，得到能够截留住一定尺寸微珠的芯片。
　　以C反应蛋白作为模型，建立了一种蛋白质核酸适体筛选的微流控SELEX平台。首先将包被了C反应蛋白的聚苯乙烯微珠固定于芯片通道的收缩段处，再通入文库，与C反应蛋白有结合能力的序列就会因结合而保留在微珠上而从整个文库中分离出来，同时在每轮正筛前采用微孔板法进行了反筛操作。以BSA为反筛靶分子共进行了10轮的筛选，对其中的第六轮、第八轮、第十轮的富集文库进行TA克隆测序及亲和力、特异性分析，获得了一条与C反应蛋白较好亲和力的核酸适体，其解离常数为3.6 nM。
　　考虑到C反应蛋白的检测常在血液中进行，而血液中HSA和IgG的含量较高，因此本文从第五轮开始以HSA、IgG和BSA为反筛靶分子进行了另外的四轮筛选。对以HSA、IgG和BSA为反筛目标的第八轮富集文库进行了分析，获得了一条与C反应蛋白特异性结合的核酸适体。其解离常数为104 nM。结果表明该平台可用于蛋白质核酸适体的快速高效筛选。

目录

文摘

英文文摘

授权书

本文所用英文缩略词表

第1章 绪论

1.1 核酸适体简介

1.2 SELEX技术的改进和发展

1.2.1 磁珠分离技术在SELEX中的应用

1.2.2 毛细管电泳分离技术在SELEX中的应用

1.2.3 微流控SELEX技术

1.2.4 固定文库筛选技术

1.2.5 其他新兴的高效筛选方法

1.3 本文拟开展的工作

第2章 微流控SELEX平台的建立

2.1 微流控SELEX筛选流程

2.2 试剂和仪器

2.3 芯片的设计和制作

2.3.1 芯片的设计和掩膜的制作

2.3.2 芯片的制作过程

2.3.3 刻蚀液成分优化

2.3.4 刻蚀温度的考察

2.3.5 刻蚀速度的考察

2.3.6 芯片形貌及尺寸的测量

2.3.7 芯片键合效果评价

2.4 C反应蛋白核酸适体的筛选

2.4.1 缓冲液配制

2.4.2 蛋白质的固定

2.4.3 C反应蛋白核酸适体的筛选过程

2.5 SPR仪测定文库富集情况

2.6 克隆测序及二级结构分析

2.7 小结

第3章 测序结果的亲和力和特异性考察

3.1 前言

3.2 仪器和试剂

3.3 实验方法

3.3.1 筛选序列的亲和力考察

3.3.2 筛选序列的特异性考察

3.4 以BSA为对照蛋白的筛选结果

3.4.1 PCR条件优化结果

3.4.2 文库的富集情况

3.4.3 克隆测序结果

3.4.4 亲和力及特异性结果

3.5 以HSA、IgG和BSA为对照蛋白的筛选结果

3.5.1 PCR条件优化结果

3.5.2 文库的富集情况

3.5.3 克隆测序结果

3.5.4 亲和力及特异性结果

3.6 C反应蛋白核酸适体的二级结构分析

3.7 小结

结 论

参考文献

附录攻读学位期间所发表的学术论文目录

致 谢