农业废物堆肥中高产漆酶新菌株的筛选鉴定、液态发酵及酶学性质研究

摘要

堆肥化在农业废物的处理中已得到了广泛的应用。木质素是农业废物堆肥过程中的主要限速有机物，其降解被认为是快速堆肥的关键。漆酶是一种含多个铜原子的多酚氧化酶，能催化氧化多种芳香族化合物，是木质素降解酶系中一员，在木质素矿化降解、腐殖质形成等过程中发挥重要作用。
　　 本研究利用秸秆等原料对农业废物堆肥过程进行模拟，从堆肥样品中分离得到一株产漆酶活力较高的菌株（菌株编号C2），对其进行了鉴定，并研究了该菌株的发酵条件、酶的分离纯化和性质以及漆酶基因。结论归纳如下:
　　 以愈创木酚被氧化显色作为检测方法，筛选出了一株产漆酶能力强的菌株。通过对该菌株培养特征、形态特征观察及ITS序列分析，鉴定该菌株属于哈茨木霉，命名为Hypocrea lixii sp.C2，其ITS序列的GenBank登录号为HQ699075。
　　 对Hypocrea lixii sp.C2的液态发酵产漆酶条件进行了优化，得到的优化培养基为:葡萄搪20 g，尿素2.21 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O2 g，CuSO40.3 g，加蒸馏水至1000mL，愈创木酚0.05％，pH4.0，30℃培养，培养时间4d。以2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐(ABTS)为底物时，优化后漆酶酶活可达200 U·mL-1，约为优化前的3倍。
　　 菌株Hypocrea lixii sp.C2液态发酵所产的漆酶通过三氯乙酸-丙酮沉淀、膜过滤、离子交换层析分离纯化后，得到电泳纯的漆酶，纯化倍数为13.2，回收率为7.4％。根据SDS-PAGE电泳，Hypocrea lixii sp.C2漆酶分子量约为60 kDa。纯化后的漆酶最适温度为35℃，最适pH为4.0;在50℃保温1h能保存80％的酶活，在60℃时漆酶半衰期＞1 h;金属离子对漆酶酶活的影响很大，其中Na+、Fe2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+对酶活有抑制作用，Cu2+对酶活有促进作用;在低浓度时，K+、Mg2+对漆酶有激活作用。以ABTS为底物时，测定该酶的米氏常数(Km)值为1.00 mmol·L-1。
　　 以Cu1AF和Cu2R为引物对Hypocrea lixii sp.C2菌株的漆酶基因进行扩增，PCR产物回收克隆后测序得到长度为148bp的漆酶基因片段。与NCBI中已知的漆酶氨基酸序列进行比对，结果表明，Hypocrea lixii sp.C2与Trichoderma sp.C1 LL-2011菌株的同源性最高。

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摘要

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附表索引

第1章 绪论

1．1 农业废物概述

1．2 堆肥化

1．2．1 厌氧堆肥

1．2．2 好氧堆肥

1．2．3 好氧堆肥过程的影响因素

1．2．4 农业废物堆肥中的难降解物质

1．3 木质素的生物降解

1．3．1 木质素的存在与结构

1．3．2 木质素的生物降解

1．4 漆酶简介

1．4．1 漆酶的结构特征

1．4．2 漆酶催化反应机理

1．4．3 漆酶作用的底物

1．4．4 漆酶酶活的测定

1．4．5 漆酶的分离纯化

1．4．6 漆酶的分子生物学

1．4．7 漆酶的应用

1．5 本课题研究的内容与意义

第2章 产漆酶菌株的筛选及鉴定

2．1 引言

2．2 实验材料与设备

2．2．1 实验材料与处理

2．2．2 培养基

2．2．3 试剂

2．2．4 实验设备

2．3 实验方法

2．3．1 取样方法

2．3．2 产漆酶菌株的筛选

2．3．3 产漆酶菌株的鉴定

2．4 结果与讨论

2．4．1 菌株的筛选

2．4．2 菌株的鉴定

2．5 本章小结

第3章 Hypocrea lixii sp．C2漆酶液体培养条件的研究

3．1 引言

3．2 实验材料与设备

3．2．1 实验材料

3．2．2 培养基

3．2．3 试剂

3．2．4 实验设备

3．3 实验方法

3．3．1 液态发酵及漆酶的制备

3．3．2 漆酶活力的测定

3．3．3 菌体千重的测定

3．3．4 液体培养条件的优化

3．4 结果与讨论

3．4．1 优化前菌株Hypocrea lixii sp．C2的液体培养

3．4．2 不同碳源、氮源对Hypocrea lixii sp．C2产漆酶的影响

3．4．3 愈创木酚加入量对Hypocrea lixii sp．C2产漆酶的影响

3．4．4 CuSO4加入量对Hypocrea lixii sp．C2产漆酶的影响

3．4．5 培养基初始pH对Hypocrea lixii sp．C2产漆酶的影响

3．4．6 培养温度对Hypocrea lixii sp．C2产漆酶的影响

3．4．7 发酵条件优化后Hypocrea lixii sp．C2液态发酵产酶曲线

3．5 本章小结

第4章 Hypocrea lixii sp．C2漆酶的分离纯化及酶学性质研究

4．1 引言

4．2 实验材料与设备

4．2．1 实验材料

4．2．2 培养基

4．2．3 试剂

4．2．4 实验设备

4．3 实验方法

4．3．1 蛋白质含量测定

4．3．2 漆酶的分离纯化

4．3．3 漆酶的酶学性质

4．4 结果与讨论

4．4．1 漆酶的分离纯化

4．4．2 漆酶的酶学性质

4．5 本章小结

第5章 Hypocrea lixii sp．C2漆酶基因片段研究

5．1 引言

5．2 实验材料与设备

5．2．1 实验材料

5．2．2 培养基

5．2．3 试剂

2．2．4 实验设备

5．3 实验方法

5．3．1 菌株培养

5．3．2 DNA提取

5．3．3 漆酶基因片段研究

5．4 实验结果与分析

5．4．1 PCR扩增结果

5．4．2 序列分析

5．5 本章小结

结论及展望

参考文献

致谢

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