竹节香附素A及其联合用药对人肝癌细胞QGY-7703的作用机制研究

摘要

癌症是人类健康的重大威胁，每年全世界有800万人死于癌症。抗癌药物的研发一直是药学研究的热点内容。传统的化学类抗癌药物副作用多且容易发生癌细胞耐药现象，严重影响了患者的生存质量。从天然产物中所提取的单体类活性成分不仅抗癌活性良好且具有较低的副作用。开发单体类抗癌药物具有十分重要的现实意义。
　　中药两头尖又名竹节香附、草乌喙，为毛茛科植物多被银莲花Anemone raddeanaRegel的干燥根茎。两头尖作为药物首次被明朝刘文泰所著《本草品汇精要》记载。竹节香附素A(Raddeanin A,RDA)是两头尖中的主要活性化学成分之一。前期研究表明，RDA具有良好的抗肿瘤活性，对肝癌、卵巢癌、肺癌等均具有良好的抑制作用。但是目前RDA的抗癌作用机制尚未明确。本文研究RDA对人肝癌细胞QGY-7703的作用情况，重点研究了RDA对QGY-7703细胞的迁移侵袭抑制作用和细胞内DNA甲基化的抑制作用及其机制。此外，还研究了RDA和细胞内NF-κB信号通路异常激活的抑制作用的关系。此外，本文还研究了RDA及其与顺铂(DDP)联用抑制QGY-7703细胞的增殖作用情况的影响和对细胞内活性氧（ROS）的影响及对凋亡相关基因表达的影响。
　　第一部分 RDA对NF-κB信号通路的抑制作用机制研究
　　我们采用sNNA基因沉默技术和RT-PCR、Western-Blot等技术研究RDA对NF-κB信号通路的抑制作用。采用免疫荧光法研究RDA对NF-κB p65亚基核转运的作用情况。采用双荧光素酶报告基因法验证了RDA对NF-κB信号通路的作用情况。实验结果表明siRNA-homo-1716沉默效果最好。在转染siRNA之后，阳性对照组中NF-κB的基因相对表达量为0.16，而空白组表达量为0.87，RDA组为0.53。在免疫荧光实验当中，RDA组NF-κB p65亚基的核转运过程受到了明显的抑制，染色的细胞数目明显减少。在双荧光素酶报告基因实验中，RDA组的萤火虫荧光素和海肾荧光素的平均比值为2.2268，对照组为1.2363，LPS诱导组为3.9714，空白组为0.8087。以上研究表明RDA能够强烈抑制NF-κB信号通路的异常激活。RDA能够抑制NF-κB蛋白家族中p65蛋白转运到细胞核的过程。双荧光素酶报告基因实验则验证了RDA能够抑制NF-κB信号通路。
　　第二部分竹节香附素A抑制DNA甲基化作用机制研究
　　我们采用CCK-8法测定RDA对QGY-7703的半数抑制浓度。采用亚硫酸氢盐法检测QGY-7703细胞中5-甲基胞嘧啶的含量。采用RT-PCR、Western-Blot等方法研究RDA对QGY-7703细胞DNA甲基化抑制作用具体作用机制。实验结果表明RDA对QGY-7703细胞的IC50为6.20μmol/L。在DNA甲基化实验中，RDA给药后5-甲基胞嘧啶相对含量为9.6％，低于空白组的14.8％，但高于阳性对照组的4.2％。在RT-PCR实验中，RDA组的DNMT1基因的相对表达含量为5.86，空白组为8.03，阳性对照组为2.07。RDA组的DNMT3a基因的相对表达含量为3.4，空白组为4.46，阳性对照组为1.5。RDA组的DNMT3b基因的相对表达含量为5.6，空白组为6.35，阳性对照组为3.1。RDA能够显著降低QGY-7703细胞中5-甲基胞嘧啶含量。其作用机制是RDA抑制了DNA甲基化转移酶DNMT1和DNMT3a活性从而发挥其抑制DNA甲基化作用。
　　第三部分 RDA联合顺铂(DDP)的抗癌机制研究
　　我们采用CCK-8法及SRB法研究RDA及其与顺铂(DDP)联合应用对肝癌细胞QGY-7703的增殖抑制作用情况。采用Transwell小室和Matrimex基质胶研究了RDA对QGY-7703细胞的侵袭和迁移抑制作用。采用V-FITC/PI双染法和PI单染法研究RDA及其与DDP联用对QGY-7703细胞凋亡情况和细胞周期的影响情况。采用分子荧光分光光度法研究RDA及其与DDP联用对细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的影响。采用RT-PCR和Western-Blot等技术研究RDA及其与DDP联合用药对QGY-7703细胞中p53、Bax、Bcl-2和Survivin四种与细胞凋亡有关的基因的表达情况的影响。实验结果表明SRB法与CCK-8法两种方法所测得的RDA与DDP对QGY-7703细胞的IC50相关性良好，二者的拟合系数为0.97。RDA与DDP在终浓度分别为5μmol/L和10μmol/L时联用具有良好的协同作用。在细胞迁移实验中，在荧光倒置显微镜下空白组的平均细胞数目为61，RDA组的平均细胞数为43，DDP组的平均细胞数为22，二者联用组的细胞数目为16。在细胞侵袭实验中，空白组的平均细胞数目为67，RDA组的平均细胞数53，DDP组的平均细胞数为21，二者联用组的细胞数目为15。流式细胞术结果表明当RDA单独使用时，处于G1期的细胞占总数的60.6％，S期细胞占总数的30.35％，G2/M期是9.05％。RDA联合DDP用药后G1期为69.12％、S期为18.76％、G2期为12.12％。阳性对照组QGY-7703细胞的凋亡率为14.26％，RDA组的细胞凋亡率为22.51％，而二者联合用药的凋亡率为59.11％。当RDA的浓度1μmol/L时DCF荧光强度为11.763，当浓度为5μmol/L时DCF荧光强度为15.075，浓度为10μmol/L时荧光强度为18.645。当1μmol/L的RDA和5μmol/L的DDP合用DCF荧光强度为19.462，而5μmol/L的RDA和10μmol/L的DDP合用时DCF荧光强度为26.295。当RDA浓度分别为1μmo l/L，5μmol/L，10μmol/L时，p53基因的相对表达量为0.91，1.28，1.64，bax基因的相对表达量为0.95，1.62，1.94，Bcl-2基因的相对表达量为2.03，1.68，1.41，survivin基因的相对表达量为2.15，1.53，1.36。当DDP的浓度为10μmol/L时，以上四种基因的相对表达量分别为1.93，2.19，1.19，1.21。联合用药组（5μmol/L的RDA和10μmol/L的DDP合用）以上四种基因相对表达量为1.75，2.01，1.29，1.26以上。研究表明，RDA与DDP联合应用对QGY-7703细胞的增殖具有抑制作用。二者合用能够有效抑制QGY-7703细胞的侵袭迁移作用且作用效果强于二者单独使用。二者合用还可以加速诱导QGY-7703细胞凋亡。RDA与DDP合用可使QGY-7703的细胞周期阻滞于G1期，明显提高细胞的凋亡率。此外，二者合用还会使QGY-7703细胞活性氧的含量显著上升，从而加速细胞的死亡。RDA与DDP联用后显著上调p53、bax基因的表达，下调Bcl-2、survivin基因的表达。通过Western-Blot实验，证明RDA与DDP合用可以有效抑制凋亡相关蛋白的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

文献综述

第一章 基于NF-κB信号通路的RDA抗癌作用机制研究

1 材料试剂与仪器

1．1 实验仪器

1．2 试剂试药

1．3 试剂盒

1．4 试药配制

1．5 细胞株

2 实验内容

2．1 细胞培养

2．2 PDTC和RDA对QGY-7703细胞的半数抑制浓度测定

2．3 RDA对NF-κB信号通路的抑制作用研究

2．4 RDA对NF-κB信号通路的蛋白表达情况研究

2．5 RDA对NF-κB p65的核转运抑制作用研究

2．6 基于双荧光素酶报告基因模型验证RDA对NF-κB信号通路的抑制作用

2．7 实验数据处理及统计分析

3 实验结果

3．1 PDTC和RDA对QGY-7703细胞的半数抑制浓度

3．2 RDA对NF-κB信号通路的抑制作用研究

3．3 RDA对NF-κB信号通路的蛋白表达影响

3．4 RDA对NF-κB信号通路p65的核转运抑制作用研究

3．5 基于双荧光素酶报告基因模型的RDA对NF-κB信号通路的抑制作用验证

4 小结

第二章 RDA抑制DNA甲基化作用机制研究

1 实验仪器与试剂

1．1 实验仪器

1．2 试剂试药

1．3 试剂盒

1．4 试药配制

1．5 细胞株

2 实验内容

2．2 RDA和DEC对QGY-7703细胞DNA甲基化作用研究

2．3 RDA对DNA甲基化转移酶的基因相对表达研究

2．4 RDA对DNA甲基化转移酶的表达研究

2．5 实验数据处理及统计分析

3 实验结果

3．1 DEC对QGY-7703的半数抑制浓度测定

3．2 RDA和DEC对QGY-7703细胞DNA甲基化抑制作用研究

3．3 RDA对DNA甲基化转移酶的基因相对表达研究

3．4 RDA对DNA甲基化转移酶的表达研究

4 小结

第三章 RDA联合顺铂的抗癌作用机制研究

1 实验仪器与试剂

1．1 实验仪器

1．2 试剂试药

1．3 试剂盒

1．4 细胞株

2 实验内容

2．3 RDA联合DDP对QGY-7703细胞的迁移作用研究

2．4 RDA联合DDP对QGY-7703细胞生长情况的影响

2．5 RDA与DDP联合用药作用的研究

2．6 RDA与DDP合用对QGY-7703细胞凋亡作用的研究

2．7 RDA与DDP合用对QGY-7703细胞内氧化作用的研究

2．8 RDA与DDP合用对QGY-7703细胞mRNA中凋亡相关基因表达的研究

2．9 RDA联合DDP对QGY-7703细胞凋亡相关蛋白的表达研究

2．10 实验数据处理及统计分析

3 实验结果

3．1 RDA合用DDP对QGY-7703细胞形态的影响

3．2 RDA联合DDP对QGY-7703细胞的迁移抑制作用研究

3．3 RDA联合DDP对QGY-7703细胞的侵袭抑制作用研究

3．4 RDA联合DDP对QGY-7703细胞生长情况的影响

3．5 RDA与DDP合用对QGY-7703细胞的细胞凋亡作用研究

3．6 RDA与DDP合用对QGY-7703细胞内氧化作用的研究

3．7 RDA与DDP联用对QGY-7703细胞mRNA中凋亡相关基因表达的研究

3．8 RDA联合DDP对凋亡相关蛋白表达研究

4 小结

结语

致谢

参考文献