核蛋白STIP介导去泛素化酶USP7分子调控的机制研究

摘要

STIP是一种核磷酸化蛋白，过表达时在核中能自我聚集成rod样的大分子结构——stiposome。STIP在人体内的多个器官，如肾，肝，肺等，以及各个发育阶段均有表达，且从线虫到人高度同源，它的表达受到干扰后，会使胚胎发育停止在16细胞阶段，说明STIP在生物进化中具有非常重要的保守功能。然而，至今STIP在细胞内的功能和作用机制仍然知之甚少。
　　USP7属于半胱氨酸蛋白酶，是泛素特异性蛋白酶家族的重要成员之一，是首个被确认的p53底物特异性去泛素化蛋白酶。USP7可以直接结合并去泛素化p53，稳定p53。同时，USP7还能结合并去泛素化p53的负调控子E3泛素连接酶Mdm2，稳定Mdm2。结构和生化研究揭示Mdm2与USP7的亲和力明显高于p53数倍，是USP7在非应激的条件下优先结合的底物。此外，USP7还能调节细胞内众多蛋白底物的活性和功能，包括抑瘤蛋白、DNA修复蛋白、免疫应答蛋白、病毒蛋白、表观遗传调节子等，在疾病的发生发展中起着重要的作用。
　　前期研究我们发现STIP通过减少Mdm2和p53的泛素化，延长Mdm2和p53蛋白的半衰期，导致Mdm2和p53蛋白的稳定，并促进肿瘤细胞的生长。由于STIP并不具有任何酶的活性和功能，为了揭示其介导Mdm2和p53稳定的分子机制，我们首先通过生物信息学的方法，分析了STIP的蛋白序列上可能结合的蛋白，发现STIP蛋白序列上有多个去泛素化酶USP7的结合位点，提示STIP与USP7很可能在细胞内发生相互作用。为了验证预测结果，我们采用激光共聚焦显微镜，通过间接免疫荧光的方法，发现内源性STIP与USP7共定位于细胞核内stiposome。进一步通过免疫共沉淀实验和GSTp(μ)ll-down实验，明确STIP与USP7在细胞内直接相互作用。为了揭示STIP结合于USP7的部位，我们将不同删除区段的USP7质粒在细胞中表达，通过免疫共沉淀实验发现，USP7的N端和C端介导了与STIP的结合。USP7作为去泛素化酶不仅能去泛素化并稳定p53，而且也能去泛素化并稳定它的负调控子Mdm2，为了明确STIP是否通过USP7来调控Mdm2和p53的稳定，我们分别通过过表达USP7、干扰USP7的表达以及突变USP7的酶活性功能区等策略，证明STIP稳定Mdm2和p53依赖于USP7去泛素化酶的活性和功能。本文通过上述研究，揭示了STIP稳定Mdm2和P53的分子机制，明确了STIP是介导USP7对Mdm2和p53调控的新分子，不仅有助于丰富Mdm2-p53通路分子调控的理论，而且为进一步探讨STIP在肿瘤中的功能作用奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词

第1章 绪论

1．1 肿瘤抑制因子p53

1．1．1 p53的结构与功能

1．1．2 p53的生理功能

1．1．3 p53的翻译后修饰

1．2 去泛素化酶USP7

1．2．1 USP7的分子结构

1．2．2 USP7对p53-Mdm2通路的调控

1．2．3 USP7在肿瘤发生发展中的作用

1．2．4 USP7作为抗肿瘤的分子靶标

1．3 STIP蛋白的研究背景

1．3．1 STIP的分子结构

1．3．2 STIP的功能

1．4 研究的目的及内容

第2章 STIP和USP7的相互作用

2．1 前言

2．2 实验材料与实验仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器设备

2．2．3 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 阳离子脂质体法瞬时转染细胞

2．3．3 蛋白质的SDS-PAGE电泳

2．3．4 免疫共沉淀

2．3．5 分子克隆

2．3．6 GST P μ ll-down

2．3．7 间接免疫荧光

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 生物信息学预测STIP结合蛋白

2．4．2 STIP和USP7在细胞内共定位

2．4．3 STIP与USP7相互作用

2．4．4 体外翻译表达GST、GST-STIP和His-USP7蛋白

2．4．5 GST P μ ll-down

2．4．6 鉴定STIP结合于USP7的部位

2．4．7 确定USP7的核定位区域

2．4．8 讨论

2．5 本章小结

第3章 STIP介导USP7对p53和MDM2的调控

3．1 前言

3．2 实验材料与实验仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器设备

3．2．3 溶液配制

3．3 实验方法

3．3．1 慢病毒侵染法构建稳定细胞系

3．3．2 质粒转染法构建稳定细胞系

3．3．3 多质粒共转染

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 在USP7存在的条件下，STIP以剂量依赖性增加Mdm2和p53的蛋白水平

3．4．2 干扰内源性USP7的表达，STIP丧失对Mdm2和p53的调控作用

3．4．3 STIP对p53和MDM2的调控依赖USP7的去泛素化酶活性

3．4．4 STIP参与了USP7对p53和MDM2的稳定

3．4．5 讨论

3．5 本章小结

结论和展望

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录

附录B 引物序列

附录C siRNA序列

致谢