基于Notch-Dell4信号通路探讨宣痹通瘀胶囊保护心肌损伤及干预血管新生作用机制的研究

摘要

目的:本课题以“祛瘀生新”治疗大法为基础，以行气化瘀扶正为治疗原则，以宣痹通瘀方促进缺血心肌血管新生为切入点，开展实验研究。以冠脉结扎制备的心肌缺血大鼠模型为研究对象，探究宣痹通瘀方对心肌缺血大鼠模型Notch/Dell4信号通路及血管新生相关因子的调控机制。明确宣痹通瘀方治疗冠心病心肌缺血的作用机制，丰富冠心病心肌缺血的研究思路，为中药促进血管新生的临床应用提供实验依据。
　　方法:
　　1.宣痹通瘀方对心肌缺血大鼠治疗作用及机制探讨的在体实验研究
　　选取健康SD大鼠96只，雌雄各半，220-250g，适应喂养1周后，进行心肌缺血大鼠模型制备，采用结扎冠脉前降支血管的方法制备心肌缺血模型，随机选取16只大鼠设置为假手术组只穿线不结扎，造模前后记录标准Ⅱ导联心电图，观测ST段偏移幅度，以ST段抬高0.2mV定为造模成功。将造模成功的75只大鼠中随机分为心肌缺血模型对照组(n=15)，麝香保心丸阳性对照组(n=15)，宣痹通瘀方低中高剂量组各15只(n=45)。分别灌胃给予麝香保心丸24.3mg/(kg·d)，宣痹通瘀方低中高剂量组给药剂量分别为0.8g、1.6 g、3.2 g/kg·d，缺血模型组与假手术组分别给予等体积的蒸馏水。药物干预时间为4周。第4周末统计大鼠死亡率，经腹主动脉取血检测血清中AST、CK、LDH、cTn、SOD活性、MDA含量。常规石蜡病理切片进行苏木精-伊红(HE)、透射电镜及免疫组化检测VEGF、Notch1的表达;提取心肌组织进行免疫荧光检测CD34的表达;提取心肌组织行RT-PCR检测VEGF、Notch1、Dell4基因的表达;提取心肌组织行蛋白免疫印迹检测VEGF、Notch1、Dell4蛋白的表达情况。
　　2.宣痹通瘀方对缺缺氧刺激的HUVEC血管内皮细胞Notch-Dell4通路的影响
　　应用HUVEC培养基进行培养，将血管内皮细胞放置于缺氧培养箱中(95％N2，5％C02)培养，分别培养2h、4h、8h。采用CCK8法检测缺血缺氧条件不同培养时间对HUVEC内皮细胞的活力影响;根据实验结果，选用缺血缺氧条件下培养4h的方法，制备HUVEC内皮细胞缺血缺氧模型。体外细胞实验分为5组:缺血缺氧模型对照组:缺血缺氧培养细胞4h;麝香保心丸阳性对照组:缺血缺氧培养细胞4h+10％麝香保心丸含药血清培养4h;宣痹通瘀低剂量组:缺血缺氧培养细胞4h+2％宣痹通瘀方含药血清培养4h;宣痹通瘀中剂量组:缺血缺氧培养细胞4h+10％宣痹通瘀方含药血清培养4h;宣痹通瘀高剂量组:缺血缺氧培养细胞4h+15％宣痹通瘀方含药血清培养4h;采用RT-PCR法检测内皮细胞中VEGF、Notch1、Dell4mRNA表达;采用Western blot检测内皮细胞中VEGF、Noteh1、Dell4蛋白的表达;对各实验组细胞进行Transwell迁移实验;对各实验组细胞进行管腔形成实验。
　　结果
　　1.宣痹通瘀方对心肌缺血大鼠治疗作用及机制的在体实验研究
　　1.1在冠状动脉结扎后5min、d1、d2、d3、d4、d5、d6和d7，与假手术组比较缺血模型组大鼠心电图ST段均明显抬高（P＜0.001; P＜0.01或P＜0.05）。在给药第2天至第7天，宣痹通瘀方高剂量组动物心电图ST段上移幅度下降（分别为P＜0.01或P＜0.05）;在给药第3天至第6天，与缺血模型组比较，宣痹通瘀方中剂量组动物心电图ST段上移幅度下降(P＜0.05);在给药第3天至第5天，与模型组比较，宣痹通瘀方低剂量组动物心电图ST段上移幅度明显下降（P＜0.05）。在给药后第2天至第5天，与模型组比较，阳性对照药麝香保心丸组动物心电图ST段上移幅度明显下降(P＜0.05)。
　　1.2在用药开始2周、4周、6周各实验组均有大鼠不同程度的死亡，与缺血模型组比较，宣痹通瘀方高剂量组大鼠死亡率明显下降（P＜0.05）。模型组动物心肌三酶AST、CK和LDH释放入血量均明显高于假手术组(均为P＜0.001)。给予宣痹通瘀方干预4w后，与模型对照组比较，宣痹通瘀方高剂量可以显著降低AST、CK、LDH含量及MDA活性，升高SOD活性(P＜0.01或P＜0.05);宣痹通瘀方中剂量可以显著降低AST、LDH含量及MDA活性，升高SOD活性（P＜0.05和P＜0.01）;宣痹通瘀方低剂量可以明显降低LDH活性（P＜0.05）。与缺血模型对照组比较，宣痹通瘀方高中剂量给药组动物均可以明显降低动物组织中的cTn的含量（P＜0.001; P＜0.01或P＜0.05），并依据给药剂量不同呈现较好的量-效关系。与缺血模型对照组比较，宣痹通瘀方高中剂量组动物心肌梗死面积明显减小(P＜0.01和P＜0.05)。光镜观察左心室纵切片HE染色，假手术组心肌细胞排列整齐，结构清晰;心肌缺血模型组大鼠心肌细胞可见凝固性坏死，核碎裂消失;宣痹通瘀方高剂量组及麝香保心丸组心肌细胞病理损伤有改善，心肌细胞排列较规则;
　　1.3免疫组化结果:与模型组比较，麝香保心丸组、宣痹通瘀高剂量组、中剂量组、低剂量组动物心肌组织内VEGF含量有显著性增高（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）;与模型组比较，麝香保心丸组、宣痹通瘀中剂量、高剂量心肌组织内Notch1含量明显降低(P＜0.01，P＜0.05);
　　1.4免疫荧光结果:与模型组比较，麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀低、中、高剂量组处理后的大鼠心肌组织CD34含量极显著升高（P＜0.01）。
　　1.5 RT-PCR结果:与假手术组比较，心肌缺血模型组的VEGF、Notch1、Dell4mRNA表达显著上调(p＜0.01);与模型组比较，麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀方低、中、高剂量组心肌组织中VEGFmRNA的表达上调(P＜0.01，P＜0.001);麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀低、中剂量组Notch1 mRNA表达显著下调(p＜0.05，p＜0.01);麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀方低、中、高剂量组Dell4mRNA的表达下调(p＜0.01，p＜0.05);
　　1.6 Western blotting结果:与假手术组比较，模型大鼠VEGF、Notch1、Dell4蛋白表达显著上调(p＜0.05，p＜0.01);与模型组比较，宣痹通瘀方低、中、高剂量组及麝香保心丸阳性对照组VEGF蛋白表达显著上调(p＜0.05，p＜0.01);宣痹通瘀方中、高剂量组Notch1蛋白表达显著下调(p＜0.05，p＜0.01);宣痹通瘀方中、高剂量组大鼠心肌组织中Dell4蛋白表达显著下调(p＜0.01，p＜0.001);
　　2.宣痹通瘀方对缺血缺氧刺激的HUVEC血管内皮细胞Notch-Dell4通路的影响
　　2.1 CCK8测定各个不同时间点缺血缺氧对细胞存活率的影响
　　与模型组比较，2h中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性药物处理组，细胞存活率变化不明显，4h中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性药物处理组细胞存活率均上升且成剂量依赖增加，与模型组比较有显著差异（P＜0.01和P＜0.001）。
　　2.2 RT-PCR结果:与对照组比较，细胞缺血缺氧模型组VEGFmRNA的表达显著下降（P＜0.001），Notch1、Dell4mRNA表达显著上升（P＜0.01）;与缺血缺氧模型组比较，麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀方低、中、高剂量组细胞中VEGF mRNA表达显著上升（P＜0.01，P＜0.001）;麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀方高剂量组细胞中Notch1mRNA的表达显著下降（P＜0.01）;麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀方中、高剂量组细胞中Dell4mRNA表达显著下降(P＜0.05，P＜0.01);
　　2.3 Western blot结果:与对照组比较，缺血缺氧组VEGF蛋白的表达显著下降（P＜0.001），Notch1、Dell4蛋白的表达显著上升（P＜0.01）;与缺血缺氧模型组比较，麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀方高剂量组VEGF蛋白表达显著上升（P＜0.01，P＜0.001）;麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀方中、高剂量组中Notch1蛋白的表达显著下降（P＜0.01，P＜0.05），麝香保心丸阳性对照组、宣痹通瘀方中、高剂量组细胞中Dell4蛋白的表达显著下降(P＜0.05，P＜0.001);
　　2.4细胞成管检测:与空白对照组相比，缺氧条件下HUVEC细胞管腔形成能力下降，主要表现为断裂管腔增多，管腔的完整性受到严重破坏;与缺血缺氧组比较随着宣痹通瘀含药血清剂量的增加，管腔受损逐渐减弱，但管腔形成能力较空白对照组弱。
　　2.5细胞迁移检测:与空白对照组比较，缺血缺氧处理组、中药高剂量组、阳性药物处理组穿过微孔膜的细胞数明显减少（P＜0.001、P＜0.01和P＜0.05）;与缺血缺氧组比较，随着宣痹通瘀含药血清剂量的增加，细胞迁移能力逐渐增强，但迁移能力较正常组弱。
　　结论:
　　1.宣痹通瘀方能够降低实验性心肌缺血病变大鼠死亡率，并具有改善心肌缺血大鼠异常心电图的作用;
　　2.宣痹通瘀方能够降低实验性心肌缺血病变大鼠心肌三酶和肌钙蛋白，可以改善心肌抗氧化作用，能够减少心肌梗死面积，能够促进心肌梗死区血管新生，具有保护心肌组织结构和功能的作用;
　　3.宣痹通瘀方能明显升高心肌缺血大鼠心肌组织VEGF的表达，抑制心肌缺血大鼠心肌组织Notch1、Dell4的表达;
　　4.宣痹通瘀方能明显上调缺血缺氧HUVEC血管内皮细胞VEGF基因和蛋白的表达，下调缺血缺氧HUVEC血管内皮细胞Notch1、Dell4基因和蛋白的表达;
　　5.宣痹通瘀方能够促进缺血缺氧HUVEC的迁移及成管;
　　6.宣痹通瘀方可以促进冠心病心肌缺血组织的血管新生，其作用机制可能与促进VEGF表达升高，调控了Notch-Dell4信号通路相关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

第一部分 文献综述

一、中医学对冠心病的认识及研究进展

1．中医学对冠心病病名的认识

2．中医学对冠心病病因病机的认识

3．历代医家对冠心病病因病机及辩证论治的不同认识

4．中医药治疗冠心病的研究进展

二、现代医学对冠心病的研究进展

1．冠心病的现代研究现状

2．针对冠心病展开的相关研究

三、中医对“祛瘀生新”理论的认识

1．中医“祛瘀生新”理论的历史渊源

2．祛瘀生新治疗法的临床应用

3．“祛瘀生新”理论在疾病不同阶段的中医内涵

四、治疗性血管新生

1．治疗性血管新生的概念

2．血管新生的发生机制

第二部分 实验研究

第一章 宣痹通瘀方对心肌缺血模型大鼠血管新生作用在体实验研究

实验一 宣痹通瘀方对心肌缺血模型大鼠心脏保护作用研究

实验二 宣痹通瘀方对心肌缺血模型大鼠心肌组织中Notch-Dell4信号通路干预作用的研究

第二章 宣痹通瘀方对缺血缺氧刺激动血管内皮细胞Notch-Dell4通路的影响

实验三 宣痹通瘀方对缺血缺氧刺激血管内皮细胞Notch-Dell4通路的影响

第三部分 讨论

结语

致谢

参考文献

附图