转录因子FOXA2生物素标记体系构建及其互作蛋白鉴定

摘要

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌作为威胁女性健康最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率在中国上升趋势明显。乳腺癌细胞的生长特性是:能无限生长、具有转化和转移能力。因此通过对乳腺癌发生、发展作用机制进行深入研究，以期为肿瘤治疗方案及临床耐药提供新的靶点。
　　生物素Avi-tag技术是指在目的蛋白的N端或C端加上由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的受体肽小标签，该小标签可被生物素连接酶BirA特异性识别，并且生物素连接酶可催化生物素转移到靶标蛋白标签上的赖氨酸残基上，导致带有标签的靶标蛋白在体内能被生物素化。该生物素化过程为酶促反应，反应条件温和，标记特异性强、专一性高，同时由于序列短小，仅仅只有15个氨基酸，对靶标蛋白的构象及活性影响极低。链霉亲和素可以特异性地与生物素结合，结合力强。因此，可在严格的洗脱条件下分离出目标蛋白及与其蛋白特异性相互作用的复合体。
　　叉头框(Forkhead box)家族蛋白被发现大量的存在于真菌及动物体内，这个家族的主要特征是作为转录因子作用于DNA结合序列，于其DNA结合区域序列的极端保守性，并且在这类家族蛋白的尾部具有特殊的翼状螺旋结构。FOXA2是Forkhead box转录因子家族的成员之一，FOXA2参与胚胎发育，同时抑制多种肿瘤细胞的转移，并在参与细胞干性维持发挥重要作用。临床上发现，在众多肿瘤样品如乳腺癌、肺癌等中发现FOXA2有较高水平的表达，FOXA2高表达或许与细胞的癌变有着密切的关联。此外，FOXA2还参与多种信号通路，包括调控致癌信号多种途径。这些都暗示转录因子FOXA2在肿瘤发生、发展中扮演着重要角色。
　　蛋白互作研究是后基因组时代一个重要研究内容，也是当前非常热门研究领域。生物体内，与外界进行信号交换，都是通过配体与细胞表面的跨膜受体结合，而后通过蛋白-蛋白相互作用层层传递至细胞核中引起特定的生理生化反应。生物机体内每一个小分子都不是独立存在的，而是通过与其它物质结合协同发挥作用，从而形成一个相互交叉紧密联系的网络。控制癌症也不能只抑制单一的信号通路，肿瘤的发生与发展是由多条不同信号通路共同参与、相互影响、相互作用的最终结果。通过以FOXA2为核心、寻找其互作蛋白，分析信号通路调节网络，对于全面认识FOXA2在细胞中的生物学功能，具有十分重要的价值。
　　本课题构建了基于生物素Avi-tag的FOXA2真核表达载体，利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXA2蛋白进行纯化，将所得的蛋白复合体进行考马斯亮蓝染色，质谱分析，然后通过生物信息学进行对比分析，寻找FOXA2可能存在的互作蛋白，然后通过免疫共沉淀等分子生物学方法进行验证，我们在研究中寻找到了FOXA2的互作蛋白FOXP2，并且通过临床样品的统计分析，发现FOXA2与FOXP2表达水平具有相关联性。本研究主要包括两点:1.建立了转录因子FOXA2生物素标记体系，实现了FOXA2在乳腺癌细胞中被生物素化，同时实现了且该蛋白Western Blotting、Pull-down等实验中无需抗体的一步法应用，快速，经济，高效。2.寻找并验证转录因子FOXA2的互作蛋白FOXP2，对FOXA2调控机制与功能的理解更进一步。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 乳腺癌概述

1．2 生物素Avi-tag技术概述

1．2．1 Avi-tag简介

1．2．2 生物素与生物素连接酶BirA的简介

1．2．3 链霉亲和素简介

1．3 转录因子FOXA2概述

1．3．1 转录因子概述

1．3．2 FOX家族概述

1．3．3 转录因子FOXA2概述

1．3．4 转录因子FOXA2的结构与分子构象

1．3．5 转录因子FoxA2的生物学功能

1．3．6 转录因子FOXA2与肿瘤

1．4．转录因子FOXP2概述

1．4．1 转录因子FOXP2结构

1．4．2 转录因子FoxP2的生物学功能

1．5 FOXA2蛋白互作概述

1．6 研究目的、内容与意义

1．7 本论文的工作设想

第2章 生物素化FOXA2真核表达体系的构建

2．1 前言

2．2 实验材料与仪器

2．3 实验方法

2．3．1 生物素化FOXA2重组表达质粒的构建

2．4 结果与分析

2．4．1 pcDNA3．1-Avi-FOXA2重组表达载体的构建及鉴定

2．5 本章小结

第3章 生物素浓度及细胞模型的选择

3．1 前言

3．2 实验材料与仪器

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养

3．3．2 质粒共转染实验

3．3．3 培养基中添加不同浓度生物素

3．3．4 Western Blotting(WB)

3．4 结果与讨论

3．4．1 生物素浓度梯度

3．4．2 细胞模型的确定

3．5 讨论

第4章 Avi-FOXA2的生物素化检测、纯化及考马斯亮蓝染色

4．1 前言

4．2 实验材料与仪器

4．3 FOXA2及生物素的表达检测

4．3．1 细胞培养

4．3．2 细胞传代

4．3．3 质粒共转染实验

4．4 蛋白纯化与电泳

4．4．1 蛋白的纯化

4．4．2 蛋白电泳

4．5 考马斯亮蓝染色

4．5．1 SDS-PAGE凝胶的配制

4．5．2 蛋白样的制备

4．5．3 电泳

4．5．4 考马斯亮蓝染色

4．6 结果与分析

4．7 本章小结

第5章 Avi-FOXA2质谱分析及结果生物信息学分析

5．1 前言

5．2 实验材料和仪器

5．3 实验方法

5．3．1 质谱前样品处理，酶解

5．3．2 LTQ质谱分析

5．3．3 MS分析

5．4 结果与讨论

5．4．1 质谱分析及生物信息学分析

5．4．2 讨论

第6章 分子生物学FOXA2蛋白互作的验证

6．1 前言

6．2 实验材料与仪器

6．3 实验方法

6．3．1 pcDNA3．1-his-FOXP2重组质粒的构建与鉴定

6．3．2 质粒共转染实验

6．3．3 蛋白免疫印迹法(WB)

6．3．4 蛋白纯化

6．3．5 免疫共沉淀验证互作蛋白

6．4 结果与分析

6．4．1 pcDNA3．1-his-FOXP2重组表达载体的构建及鉴定

6．4．2 免疫共沉淀FOXA2互作蛋白的验证

6．5 讨论

第7章 临床样本中转录因子FOXP2与FOXA2表达量具有的相关性

7．1 前言

7．2 实验材料与仪器

7．3 实验方法

7．3．1 临床组织样本中蛋白的提取

7．3．2 Western Blotting(WB)

7．3．3 统计分析

7．4 结果与讨论

7．4．1 乳腺癌临床样本中FOXA2与FOXP2蛋白的表达情况

7．4．2 讨论

总结与展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文目录

致谢