热激对小鼠TM4支持细胞代谢及生殖功能的影响

摘要

男性不育是世界医学难题，且其影响因素众多，如遗传因素、免疫因素、环境因素（电离辐射、超声、微波、温度）等。其中，温度对于正常精子发生至关重要。研究表明，隐睾症或睾丸长期处于高温环境会引发热激，热激会诱导生精细胞凋亡，并常伴随支持细胞形态与功能的改变。然而，热激诱导的支持细胞功能异常及其在男性不育发生中的作用机制，研究得还不是很清楚。支持细胞代谢调节与精子发生密切相关，支持细胞通过类“瓦伯格效应”产生的乳酸，是生精细胞的重要能量底物。已有研究表明乳酸能抑制生精细胞凋亡，且外源注入乳酸能促进隐睾症大鼠精子发生。因此研究热激对支持细胞代谢及生殖功能的影响，对提高男性生殖健康具有积极意义。
　　基于以上研究背景，本文以男性隐睾性不育症患者的睾丸活检组织为组织模型，以小鼠睾丸支持细胞系（TM4细胞）为体外细胞模型，从代谢角度探讨热激对睾丸组织和睾丸支持细胞功能的影响。本课题从以下3个方面展开工作：
　　1、隐睾性不育症相关代谢基因的筛选和生物信息学分析
　　采用qPCR array技术检测119个代谢相关基因在隐睾性不育症患者和生育力正常男性的睾丸组织中的表达差异。筛选出了5个表达显著差异基因：LDHA、IGF1、MCAT、CRAT、ARG2。并利用GEO数据库分析这5个差异表达基因与无精子症、畸形精子症的关系。通过分析这5个代谢基因在3种不育病理类型中的表达差异，发现LDHA的表达水平变化最显著，且在隐睾性不育症患者和畸形精子症患者睾丸组织中均是显著下调。
　　2、热激对TM4细胞代谢功能的影响
　　（1）TM4细胞热激模型的建立
　　热激会激活细胞内HSFs和HSPs等多种因子表达，其中HSP70/90表达水平与细胞热激密切相关。通过凋亡分析和HSP70/90 mRNA表达水平分析，检测热激对TM4细胞这两个指标的影响。最终确定 TM4细胞热激模型的处理方式为：43℃水浴处理TM4细胞30min，接着进行梯度时间修复6h、12h、24h。
　　（2）热激对TM4细胞代谢功能的影响
　　在成功构建TM4热激模型的基础上，通过qPCR和Western Blot，分别检测LDHA在mRNA与蛋白水平对热激的响应。发现TM4细胞受热激后，LDHA mRNA水平表达下调，而蛋白水平无明显变化；利用代谢生化分析方法检测发现乳酸产量和葡萄糖摄取量都显著下调。由这两组结果提示，TM4细胞受热激后，代谢水平减慢。
　　3、干扰LDHA表达对TM4细胞代谢及生殖功能的影响
　　鉴于LDHA在TM4细胞高表达，本文采用RNA干扰技术降低LDHA表达。结果显示TM4细胞乳酸脱氢酶活性、乳酸产量和葡萄糖摄取量均显著下降；而ATP和ROS产量显著增加，表明干扰LDHA表达促进了线粒体呼吸。MTT和划痕实验结果表明，干扰LDHA表达抑制TM4细胞增殖和迁移能力。同时干扰LDHA表达后，TM4中组成血睾屏障的主要连接分子（ZO-1, ZO-2,β-catenin, Occludin, N-cadherin）的mRNA表达水平均下调，其中ZO-1, ZO-2的mRNA表达水平显著下降，进而提示干扰LDHA表达可能破坏了TM4细胞之间的细胞连接与血睾屏障，从而影响精子发生等生殖功能。
　　综上，本研究确定了热激能显著改变支持细胞的代谢水平，其中参与乳酸生成的LDHA是重要的响应因子。降低LDHA表达会改变睾丸支持细胞代谢及生殖功能，提示LDHA可作为热激所致生精功能障碍的一种候选指标分子。

目录

声明

主要缩略词表

第一章 绪 论

1.1精子发生

1.2血睾屏障与精子发生

1.3支持细胞的代谢调节和精子发生

1.4论文研究思路

第2章 隐睾性不育症相关代谢基因的筛选和生物信息学分析

2.1引言

2.2材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 热激对TM4细胞代谢功能的影响

3.1引言

3.2材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 干扰LDHA表达对TM4细胞代谢及生殖功能的影响

4.1前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4本章小结

结论

参考文献

附录A 攻读硕士学位期间发表的论文

附录B 代谢基因引物序列表

致谢