预吸胀过程中绿豆胚轴脱水损伤与线粒体途径凋亡关系的生理生化分析

摘要

脱水耐性和脱水敏感性是种子发育与萌发过程中非常重要的一对性状，与种子萌发、休眠、引动和寿命均有密切的关系。以往的主要研究主要将机制集中在脱水耐性的物质基础及形成脱水耐性的分子机制上，将脱水敏感性仅看作是脱水耐性性状的反面。程序性细胞死亡(PCD）是植物发育与应答环境胁迫的重要手段之一，在植物应对水涝缺氧、干旱失水等应答过程中，PCD都发挥了重要作用。因此，我们为脱水敏感性的解释建立了线粒体途径PCD假说，即脱水敏感性的实质是由线粒体途径 PCD致胚轴细胞死亡从而导致生活力下降，并拟从形态变化、PCD事件生理生化分析和比较转录组等方面对所提假说进行验证。
　　论文的主要研究结果如下：
　　1.对绿豆种子吸胀萌发过程中进行脱水处理后的含水量和生长指标结果表明预吸胀0h，3h，6h，18h，24h是生长指标发生变化的重要转折点，可作为不同脱水耐性/敏感性材料的处理时间；脱水25h是含水量平衡的主要时间节点，可作为脱水处理的标准时间。
　　2.活性氧代谢与抗氧化系统的研究结果表明绿豆胚轴脱水敏感性直接体现为脱水后迅速提升的活性氧代谢水平和抗氧化能力的丧失。在活性氧代谢方面， H2O2与膜质过氧化、膜渗漏率和玻璃化形成物质的相关性最高，应当被认为是主要诱导因子。在抗氧化系统方面，绿豆胚轴的脱水耐性丧失与其自身抗氧化能力有直接联系，且其损失程度与膜脂过氧化和电解质渗漏率密切相关。
　　3.非酶抗氧化物质的检测结果显示，在预吸胀后期脱水明显导致抗氧化物质受到了明显损失，但作为基础还原力的GSH开始发生亏缺。依此判断，在不同吸胀后脱水的绿豆胚轴中脱水所产生的活性氧在水化程度达到正常植株含水量之前并未达到直接攻击的高水平。因此，脱水产生的活性氧所致的脱水敏感性应该与活性氧诱导的PCD有关。
　　4.玻璃化形成物质测定的结果表明绿豆胚轴的脱水耐性丧失与非还原性糖和脯氨酸等玻璃化形成物质的变化有关，同时，脱水对这些物质的明显诱导作用也可以从侧面解释吸胀后脱水仍可诱导脱水耐性的引动现象。
　　5. Evans Blue和TTC染色以及光学和亚细胞形态的研究结果明确提示了脱水胁迫诱导的氧代谢失衡是最终落实到胚轴分生组织发生细胞死亡从而降低种子生活力。DNA完整性和 Caspase与总核酸酶活性的变化结果则证明了 PCD是胚轴发生分生组织细胞死亡，继而导致种子生活力下降的主要原因。
　　6.线粒体膜电位原位染色与流式细胞定量实验和细胞色素 C的荧光原位定位实验的结果，并结合线粒体形态变化的结果证明了线粒体作为重要的诱导和传递者参加了脱水应答过程中的 PCD，即线粒体凋亡途径是脱水诱导 PCD的主要形式。而细胞质 Ca2+浓度的研究结果表明 Ca2+信号在诱导 PCD过程中应当发挥了作用，按照发生的时序其上游信号应直接是脱水诱导的水势变化，其下游则是ROS和线粒体的PT孔道。
　　7.综合分析PCD各主要事件发生的时序，可以认为脱水诱导PCD的主要机制是线粒体凋亡途径的，其过程主要分为：脱水诱导，Ca2+和线粒体呼吸电子传递变化，ROS和 Ca2+诱导线粒体膜电位翻转，细胞色素 C释放诱导 PCD下游信号传递并最终执行。
　　8.比较转录组全部样品组装后获得的92,155条 Unigenes，对其进行的 GO分析的结果提示了“细胞外组分”和“转录调控因子”等功能组。在脱水耐性丧失转变的关键时期，DEGs中“细胞杀伤”、“翻译调控因子”和“生长”等功能组是主要的成分。而 KEGG分析的结果则提示了碳代谢的变化，如 PPP途径变化是其中重要的组成部分。同时，也提示了“苯丙素的生物合成”，“半胱氨酸与蛋氨酸合成”，“植物-病原应答”和“吞噬作用相关”等功能组。COG分析的结果则提示了“转录”，“细胞壁/膜”和“脂代谢”等功能组。除了也指向转录调控因子的变化以外，也明确了细胞膜和脂类氧化可能与脱水耐性变化有关。
　　9.与脱水耐性相关的具体 DEGs分析中，锁定了 LEAs，SUTs，抗氧化酶和HSP等基因。LEA基因表达差异结果表明其被脱水诱导的丰度与预吸胀时序呈负相关，其表达丰度变化也可以明确LEA蛋白在脱水耐性机制中发挥着核心执行者的作用。S U Ts基因有高水平的表达，说明糖的转运可能也在脱水耐性的形成中发挥了重要作用。 Cu-Zn SOD和过氧化物酶基因的差异表达印证了活性氧代谢的主要产物从预吸胀早期的超氧阴离子自由基转换到了中后期H2O2。DEGs的分析中还发现 HSPs参与胚轴脱水耐性的方式是双功能的，即预吸胀早期以HSP20为核心作为调控因子而存在，预吸胀后期以HSP70为核心作为分子伴侣而存在。
　　10.与脱水耐性相关的具体 DEGs分析中，还锁定了一系列转录因子基因的表达，主要包含AP2，MYB等。通过生物信息分析构建的主要通路有脱水胁迫通过 AP2转录因子与 SUT偶联，以蔗糖/多糖代谢来影响脱水耐性；脱水胁迫产生的ABA信号，通过ABI5、MYB、HSP20等转录因子与LEA和CP47等偶联，以保护酶和光合作用基因调节达到脱水耐性；脱水胁迫通过 NAC转录因子与细胞内代谢偶联，通过影响细胞壁的结构来达到脱水耐性；脱水胁迫通过 bZIP和MYB等转录因子与次生代谢(如多酚合成）和氧化酶偶联，以抗氧化保护作用来产生脱水耐性。
　　11.与PCD直接相关的DEGs分析中，锁定了 metacaspase，内切核酸酶和细胞色素C等线粒体凋亡途径中主要因子的相关基因。其表达差异结果表明，从预吸胀早期到中后期，metacaspase基因和核酸内切酶基因在吸胀后期脱水后明显增加了类型和表达丰度；细胞色素C相关基因则从正常线粒体电子传递转向了细胞色素C的合成和转运，在基因表达层面证明了线粒体途径凋亡是预吸胀中后期重要的伤害方式。
　　综合这些结果，可以认为 PCD，尤其是线粒体途径 PCD可能是脱水耐性丧失后脱水导致种子生活力下降的重要方式。换言之，脱水敏感性的实质是脱水耐性玻璃化状态在水化弛豫后脱水诱导PCD所致胚轴分生组织细胞的不可逆损失。

目录

声明

英文缩略词表

第1章 种子脱水耐性与细胞凋亡关系的研究进展

1.1 种子脱水耐性的研究进展

1.2 种子程序性细胞死亡的研究进展

1.3种子脱水耐性/脱水敏感性与程序性细胞死亡的关系

1.4 本研究的基本假设与技术路线

第2章 预吸胀绿豆种子脱水耐性丧失的数理分析与实验模型建立

2.1材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第3章 预吸胀绿豆种子脱水耐性丧失的生理生化变化

3.1材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第4章 不同脱水条件下预吸胀绿豆胚轴细胞线粒体途径凋亡的生化分析

4.1材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第5章 不同预吸胀绿豆胚轴脱水前后的比较转录组学初步分析

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 小结

结论

参考文献

附录A

附录B 攻读学位期间所发表的学术论文(专利)目录

致谢