肽类化合物对H37Ra抑制的优化筛选

摘要

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染疾病，现有研究表明结核杆菌被巨噬细胞吞噬后，在胞内转为持留状态，通过乙醛酸循环获取能量，至今尚未在人等哺乳动物中（小鼠除外）发现此循环。现有药物会随着患者免疫力下降或者停药，而重新致病。因此研究新型抗结核药物迫在眉睫。异柠檬酸裂解酶(ICL)是结核杆菌在人体内处于持续感染状态时乙醛酸支路代谢中的关键限速酶，是其潜伏状态下生存所必需的。因此，本文以ICL为靶点研发抗结核药物。
　　本研究利用Fmoc固相合成法合成多肽抑制剂，HPLC色谱仪纯化合成的多肽并进行质谱检测。通过H37Ra抑菌实验，确定不同培养基条件下多肽的抑菌效果，并测定其最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)。加入不同浓度Vc，比较抑菌效果，进一步优化筛选多肽抑制剂。
　　本研究共筛选得到4条多肽且均有抑菌效果，并与剂量相关。结果表明，浓度为800～1500μg/mL时，各组多肽均有抑菌作用。浓度为500μg/mL时，正常培养基中只有一种肽有抑菌作用，而限制碳源培养基中均不能抑菌。筛选出一个多肽（2号）抑菌效果最好，在正常培养基中MIC为200μg/mL，限制碳源中为500μg/mL。
　　根据MIC结果，抑菌实验检测到多肽、利福平和异烟肼的抑菌效果与剂量相关。
　　筛选2号肽通过MTT比色法进行细胞毒性试验，细胞选用具有吞噬作用的THP-1细胞。结果表明，肽浓度增大为2.0mg/mL时，MTT检测细胞毒性较小。采用2.0mg/mL进行胞内实验，进一步检测其生物活性。H37Ra感染THP-1，筛选肽对H37Ra在巨噬细胞内生存能力的测定结果表明，细菌已经被细胞有效吞噬。菌落计数显示，H37Ra感染THP-1后细菌可在胞内繁殖，且随感染时间延长数量增加。当肽为2.0mg/mL时，4d、7d菌落数均下降，细菌生长受到明显抑制。这说明在较低的浓度下，2号肽表现出对胞内细菌的抑制作用。
　　本研究证明从生物信息学出发，通过筛选肽MIC、肽最小细胞毒性、筛选肽胞内抑菌一系列操作优化实验确定有效的多肽。试验结果为进一步探索结核杆菌抑制剂奠定了良好的基础。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 课题研究背景及意义

1．2 新型抗结核药物研究进展

1．3 多肽药物研究进展及展望

1．4 小结

第二章 材料与方法

2．1 主要试剂

2．2 实验仪器

2．3 其它耗材

2．4 实验菌株与细胞

2．5 常用试剂配置

2．6 直链肽的合成

2．7 环肽的固相合成

2．8 肽类化合物对H37Ra最小抑菌实验

2．9 筛选多肽对细胞毒性作用测定

2．10 筛选多肽对巨噬细胞胞内H37Ra株的抑制作用

第三章 实验结果

3．1 直链肽的合成与分析测定

3．2 环肽的合成与分析测定

3．3 不同培养基H37Ra菌株培养

3．4 肽类抑制剂对H37Ra株的抑制作用

3．5 Vc对H37Ra的抑制作用

3．6 细胞毒性实验结果

3．7 筛选多肽对巨噬细胞胞内H37Ra株抑制作用检测

第四章 讨论

第五章 结论

致谢

参考文献

作者简介

攻读硕士学位期间研究成果

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