膜片钳实验技术在血竭颜面部镇痛分子机制研究中的应用

摘要

对中药和天然药物进行有效成分研究和提取是中药现代化进程中中药药理学研究的关键性问题，也是揭示中医药的科学本质、开发创新药物的重要途径之一。 血竭是我国的传统名贵中药之一，在防治心血管疾病、治疗风湿疼痛症、抗癌等方面开发利用潜力大。然而目前对血竭药理作用机理的研究大多集中在其活血化瘀方面，为数不多的血竭镇痛作用机理的研究也仅与其抗菌消炎止痛有关。但血竭能缓解神经性痛的实验现象提示我们血竭的镇痛作用机理可能还与其直接干预了痛觉信息的传入有关。由于血竭是一种中药，化学成分复杂，从分子水平来解释它的这种效应，理应阐明其药效物质。为此，鉴于三叉神经节细胞膜上的电压门控性钠通道在头面部疼痛发生机制中的重要作用，我们对血竭进行有效成分、有效部位(群)快速定量确定和在分子水平上分析其药理机制的系统性实验和计算机模拟研究，在系统分析研究结果的基础上，提出有效成分定量化的确切定义及中药有效成分研究的方法学，确定血竭干预头面部痛觉信息中枢传入的药效物质，并将此研究作为中药现代化中有效成分确定和药理机制深入分析的一个例证。 本文首先应用全细胞膜片钳技术观察了血竭对小鼠三叉神经节细胞河豚毒素敏感型和河豚毒素不敏感型两类电压门控性钠通道电流的影响。结果，血竭对两种钠通道电流均有浓度依赖性的抑制作用，0.1％的血竭影响两类钠通道的激活和失活过程，并使TTX-R钠电流I-V曲线峰值向右偏移，延缓其复活过程。表明血竭除抗炎镇痛外，还通过调制TG细胞电压门控性钠通道，干预头面部痛觉信息的中枢传入产生镇痛作用。 为确定血竭产生上述镇痛效应的药效物质基础，采用化学方法将最有可能产生镇痛效应的血竭黄酮部位提取分离，并应用膜片钳技术观察了血竭黄酮部位对小鼠TG细胞两类钠通道电流的影响，用Hodgkin-Huxley模型拟合血竭黄酮部位作用前后的河豚毒素敏感型钠通道电流，进行参数估计。结果，0.1％血竭黄酮部位对两类电压门控性钠通道电流均有浓度依赖地抑制作用，并影响钠通道电流的失活和复活过程，而对其激活过程无明显影响，表明上述抑制作用发生在钠通道的失活态和复活态。 采用化学方法进一步从血竭黄酮部位中提取分离五种化学单体成分：龙血素B、剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、紫檀芪和黄烷，应用全细胞膜片钳技术观察了几种主要单体化学成分对小鼠TG细胞两类钠通道电流的影响。结果，0.2mmol/L龙血素B对两类电压门控性钠通道电流均有浓度依赖地抑制作用，并影响钠通道电流的失活过程，而对其激活和复活过程无明显影响，表明上述抑制作用发生在钠通道的失活态而非激活态。而另一种单体成分剑叶龙血素B同样能可恢复性地抑制TG细胞钠通道电流，只是抑制程度不及龙血素B；0.2mmol/L剑叶龙血素B影响钠通道的激活和复活过程，而对失活过程无明显影响，表明血竭总黄酮很可能是通过其所含的几种单体成分分别作用于通道的不同动力学阶段而表现出对钠电流的较强抑制作用的。 总结上述实验结果，建立中药药效物质的现代概念――有效成分的定量化定义和相应的研究策略，并据此将血竭、血竭黄酮部位及其各单体化学成分的药理效应参数进行比较，发现0.1％血竭黄酮部位与0.1％血竭的药理效应参数有高度的一致性，从而确定血竭调制TG细胞钠通道电流的有效部位为血竭黄酮部位；0.2mmol/L单体化学成分龙血素B、剑叶龙血素B与0.1％血竭的药理效应参数有较高的一致性，从而确定龙血素B是血竭调制TG细胞电压门控性钠通道电流，产生头面部镇痛效应的主要有效成分，剑叶龙血素B为其辅助性成分。 本研究不仅有利于中药血竭的进一步推广，更将为其二次开发和现代化应用提供可靠的依据，并期能为现代中药药理学研究提供些许可借鉴的方法学。