集胞藻PCC6803基因slr2049定点突变及其体内重组功能研究

摘要

2006年,Zhao等在鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120中发现了一种色素裂合酶基因cpeS(编号为alr0617),该基因编码的色素裂合酶CpeS可以催化藻蓝胆素(PCB)连接到藻蓝蛋白或者藻红蓝蛋白的β亚基Cys-84位点上。经过同源软件的分析,在集胞藻Synechocystissp.PCC6803中,找到了基因slr2049,它和基因cpeS具有很高的同源性。本实验室已经对基因slr2049的功能有了初步的研究,证明该基因所编码蛋白是具有与其同源蛋白CpeS有相似的功能,即也是一种色素裂合酶。
　　为了进一步的对该基因的结构与功能的相互关系有深刻的了解,本实验运用定点突变技术,对蛋白Slr2049的某些氨基酸位点进行点突变。针对的氨基酸位点是通过比对软件,让Slr2049和其他六种有相同功能的蛋白CpeS蛋白序列进行对比,得到的22个保守性的氨基酸位点中选取八个,选取这些氨基酸位点同时也考虑它们的结构特点与理化性质。在大肠杆菌中合成具有荧光性的藻蓝蛋白β-亚基的需要另外的3个相关基因:血红素加氧酶1基因(ho1),藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)以及脱辅基蛋白β亚基基因(cpcB)。首先通过改进的提取DNA的方法来提取集胞藻PCC6803的总DNA,再设计引物同时在引物上加入相应的酶切位点,进行PCR得到目的片段;构建野生型slr2049和八个突变体slr2049以及上述三个相关基因的克隆质粒,将以上的这些基因两两结合构建成表达质粒pCDF-cpcB-slr2049野生型和八个pCDF-cpcB-slr2049突变体以及pET-ho1-pcyA,然后将野生型和突变体的表达质粒分别与pET-ho1-pcyA共转化入大肠杆菌BL21体内,让它们进行异源体内重组,通过IPTG的诱导,得到了重组蛋白;由于载体上自带了组氨酸标记,得到的野生型重组蛋白和突变体的重组蛋白可用镍柱亲和层析的方法进行纯化,再把它们分别进行光谱测定。
　　SDS-PAGE和光谱测定的实验结果显示,野生型slr2049和突变体slr2049(H21S)/slr2049(L23S)/slr2049(F25S)/slr2049(W72L)/slr2049(G84S)/slr204-9(Y124S)催化的重组蛋白分别在623nm和640nm左右有最大吸收峰和荧光发射峰,与天然的蛋白的最大吸收峰和荧光发射峰分别在625nm和645nm相近;而突变体slr2049(A24S)/slr2049(R107S)所催化的重组蛋白则没有出现最大吸收峰和荧光发射峰;突变体slr2049(L23S)/slr2049(W72L))/slr2049(G84S)所催化的重组蛋白虽然有吸收峰,但是吸收峰处的最大值与野生型slr2049催化的重组蛋白的吸收峰值相比明显要小很多。可知野生型slr2049和突变体slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(A24S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(R107S)、slr2049(Y124S)之间是有光谱吸收峰值差异的,这可以说明这八个突变位点对催化形成藻蓝蛋白β亚基的能力也是有差异的。从光谱图上可说明24、107位的丙氨酸和精氨酸是色素裂合酶必需氨基酸,是其酶活中心;21、25、124位的组氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸对色素裂合酶的催化作用无明显影响,不是必需氨基酸;23、72、84位的亮氨酸、色氨酸和甘氨酸是色素裂合酶催化作用的关键位点,这三个氨基酸的突变能影响它的活性,降低它的催化能力。造成这一差异可能的原因是氨基酸的定点突变能造成蛋白的结构和溶解性改变,从而影响了蛋白的催化能力。
　　为了了解上述的重组蛋白是否是有效表达的,同时证明另外两个突变体有没有进行有效的表达,用特殊制作的一抗,进行Westernblot反应。通过SDS-PAGE和Westernblot技术对各表达蛋白进行了检测和验证。结果发现,由野生型slr2049和突变体slr2049(H21S)/slr2049(L23S)/slr2049(F25S)/slr2049(W72L)/slr2049(G84S)/sl-r2049(Y124S)催化形成的蛋白是藻蓝蛋白β亚基,其得到了很好的表达,没有出现缺失,而突变体slr2049(A24S)/slr2049(R107S)没有催化形成藻蓝蛋白β亚基,证明它们是没有色素裂合酶的活性的,这两个位点对色素裂合酶的催化功能是很重要的。

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第1章 绪 论

1.1蓝藻

1.2 集胞藻PCC 6803研究进展

1.3藻胆体和藻胆蛋白的研究进展

1.4研究内容和设计方案及其意义

第2章集胞藻（Synechocystis PCC 6803）四个基因

2.1引言

2.2 实验材料与方法

2.3实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

2.6本章小结

第3章 slr2049突变体的构建

3.1 引言

3.2实验材料与方法

3.3 结果与分析

3.4讨论

3.5 本章小结

第4章 基因slr2049以及其突变体和三个相关基因表达载体的构建和共表达

4.1引言

4.2 实验材料、试剂与仪器

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 本章小结

第5章 合成的重组蛋白的光谱特性

5.1 引言

5.2 实验材料和方法

5.3 实验过程

5.4 结果与分析

5.5讨论

5.6 本章小结

第6章 体内重组蛋白slr2049和其突变体表达产物的

6.1 引言

6.2 实验仪器和材料

6.3实验过程

6.4 结果与分析

6.5 讨论

6.6本章小结

结 论

参考文献

致谢

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