高温抑制红肉猕猴桃果肉着色的相关基因及软枣猕猴桃野生居群遗传学研究

摘要

1、高温是阻碍红肉猕猴桃花青素积累，导致果肉颜色变浅的重要环境因子。但是，高温抑制红肉猕猴桃着色的根本机制在很大程度上还不明确。利用高通量转录组测序技术获得大量的转录组序列，挖掘出参与花青素合成，降解和调控的相关候选基因。取正常着色开花后120天的‘红阳’猕猴桃，保留果柄，在不同温度（25℃和40℃）下分别培养2、4、6和8天。在illuminated测序平台获取不同培养阶段两个温度下内果皮的cDNA文库序列，共产生2096万个读长。将9个cDNA文库的所有序列与猕猴桃的参照基因进行比对，拼接成59884个contigs。将10953个预测蛋白与KEGG数据库进行比对，共6537个蛋白获得了KO number，参与327个代谢通路。根据基因功能注释，找到与查尔酮合成酶、查尔酮异构酶、黄酮醇合成酶、无色花青素双氧酶、花青素还原酶、还原酮醇4-还原酶、UDP-葡萄糖基转移酶、苯丙氨酸酶功能相关的98个基因。这些基因在40℃下的表达量比25℃下的表达量低。但是与其他功能相关的基因在40℃的表达量高于25℃的表达量，如与花青素相关的MYB成员，花青素5-芳香酰基转移酶，以及其他的UDP-葡萄糖和黄酮类3-O-葡萄糖基转移酶。表达谱结果分析表明高温可以抑制花青素的合成，高温影响红肉猕猴桃果肉着色可能通过影响细胞自我修复因子（抗氧化剂）、热休克因子、花青素途径、花青素途径相关的转录因子、信号转导及发育等重要特性和生物途径。大量的转录组数据为红肉猕猴桃在高温下花青素相关的分子和生物化学途径提供了全面的见解和切入点。
　　2、为研究野生软枣猕猴桃种质资源的遗传多样性，从来自中华猕猴桃基因组的SSR引物中筛选出15对适合软枣猕猴桃居群的SSR引物。通过对中国东北到西南5个野生软枣猕猴桃居群的遗传多样性分析，共发现240个等位基因，平均每个位点的等位基因数为15个，每个位点的等位基因数在2个到37个之间。SSR标记的平均多态信息含量（PIC）在0.412-0.938之间，平均多态信息含量为0.7774。其中雅安天全居群的观察杂合度最高，吉林露水河居群的观察杂合度最低。五个居群的基因流值较高，地区间的遗传多样性的变异较大。根据分子方差分析，居群间的遗传分化仅为16.62％，居群内的遗传分化占83.38%；聚类分析结果显示，秦岭眉县和秦岭户县聚为一类，大巴山居群与吉林露水河居群聚为一类，UPGMA系统树可以看出，大多数个体按照居群聚类，但是，有少数几个居群间存在基因交流的现象，如秦岭户县和雅安天全之间，秦岭户县和眉县之间，露水河和大巴山之间，Mantel相关性检测结果显示居群的遗传距离与地理距离呈较高正相关（r=0.6329，p=0.0308）。由此可知，软枣猕猴桃多样性最高的地区是秦岭或与其临近的大巴山。其遗传分化主要存在于居群内部。尽管大巴山与秦岭之间的距离比露水河更近，但是大巴山与露水河居群的遗传学距离较近，这可能与北部地区与外界物种交换过程有一定关系。在物种保护策略上，同时要运用迁地保护和就地保护方式。另外，中国东北地区的野生软枣猕猴桃是育种计划的有效资源，也为今后育种改良提供好的机会。

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第一章 绪论

1.1 红肉猕猴桃产业发展及着色调控研究进展

1.2 软枣猕猴桃遗传多样性研究进展

第二章 高温下红肉猕猴桃转录组及表达谱分析

2.1 引言

2.2实验材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 果实的温度处理

2.2.3 总RNA提取与质检

2.2.4 cDNA文库构建

2.2.5 文库质检

2.2.6 上机测序

2.2.7 生物信息分析

2.3结果与分析

2.3.1温度处理对猕猴桃果肉颜色的影响

2.3.2 文库质量检测及转录组测序质量检测结果分析

2.3.3表达谱分析

2.4 讨论

2.5总结与展望

第三章 软枣猕猴桃野生居群遗传学研究

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 软枣猕猴桃基因组总DNA提取

3.2.3 引物的选择

3.2.4 SSR-PCR反应

3.2.5 琼脂糖凝胶电泳检测

3.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

3.2.7 选择引物

3.2.8 群体验证

3.2.9数据记录与分析

3.2.10遗传多样性分析

3.2.11 聚类分析

3.3 结果与分析

3.3.1 猕猴桃DNA质量检验

3.3.2引物筛选

3.3.3 五个群体中93个样品对应的15对引物扩增结果分析

3.3.4 软枣猕猴桃居群遗传多样性分析

3.3.5软枣猕猴桃居群间的遗传分化

3.3.6软枣猕猴桃自然居群分子方差分析（AMOVA）

3.3.7聚类分析

3.3.8 野生软枣猕猴桃五个居群个体聚类图分析

3.4讨论

3.4.1 DNA的提取

3.4.2 适合野生软枣猕猴桃微卫星分子标记的引物筛选

3.4.3 软枣猕猴桃野生居群的遗传多样性

3.4.4 软枣猕猴桃野生居群间的遗传分化

3.5 小结与展望

参考文献

致谢

附录A 攻读学位期间发表的论文