Microbacterium sp.中关键羰基还原酶的分离纯化及性质研究

摘要

手性醇是合成手性药物的重要中间体。其中,利用细胞及酶催化前手性羰基不对称还原合成手性醇因其独特的优势成为近年来国内外研究的热点。为深入认识生物催化机理及对酶进行改造,本论文先从Microbacterium sp.分离纯化关键性羰基还原酶,并考察其酶学性质,利用生物信息学进行了相关研究。主要包括:
　　 实验室以苯乙酮为唯一碳源,成功从土壤中筛选出一株能高效催化苯乙酮不对称还原的菌株Microbacterium sp.。为了从蛋白质水平研究其酶学催化机制,我们首先开发出从高效菌株Microbacterium sp.分离纯化出关键性的羰基还原酶的分离纯化技术。主要过程为利用超声波破碎提取出粗酶液,经过硫酸铵分级盐析、DEAE阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析纯化目的酶。通过该分离纯化最终得到电泳级纯的羰基还原酶。纯化倍数为81倍,收率为29.6％,比活力为16.2U/mg。通过酶分子量测定,确定该酶为由两个相同亚基组成的二聚体,分子量为61.9kDa。
　　 进一步研究了该羰基还原酶的酶学性质。结果表明,该酶是依赖NADH为辅酶的氧化还原酶。酶的最适反应温度为40℃,催化还原反应的最适pH为7.0。该羰基还原酶的热稳定性较好,对环境pH的变化较敏感,在pH值6.0至8.0之间较为稳定。部分金属离子对该酶的活性具有激活作用,特别是Fe2+对其具有显著促进作用,但Cu2+对羰基还原酶有强烈的抑制作用。
　　 同时,本文对催化不对称还原的羰基还原酶生物信息学进行初步研究。对来自Candidaparapsilosis(近平滑假斯酵母,TrEMBL ID:B2KJ46),Candida magnoliae(木兰假斯酵母,TrEMBL ID:Q9C4B3)和Pichia stipitis(树干毕赤氏酵母,TrEMBL ID:A3GF07&A3GF05)的四种羰基还原酶进行多序列比对、活性位点与二级结构的预测。结果表明目的序列同源性很高;其中三种目的序列均含有SDR家族蛋白中的典型保守结构区域PS00061,并在其中都存在Y(酪氨酸)位氨基酸残基活性催化位点;二级结构均以无规卷曲为主,其次为β-片层和α-螺旋,无β-转角。
　　 本论文为深入研究催化过程的酶反应机制奠定了酶学基础;并通过对酶学性质与生物信息学的研究,对酶的进化具有指导作用。该酶具有很高的催化活性,同时具有优异的稳定性,显示很好的应用潜力。