大叶紫珠总黄酮抗氧化活性及抗鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤机制的研究

摘要

目的：
　　探讨大叶紫珠总黄酮（Total Flavonoids from Callicarpa macrophylla，TFCM）体外抗氧化活性以及对鱼藤酮（Rotenone，Rot）诱导的SH-SY5Y细胞损伤的机制。
　　方法：
　　1. TFCM含量测定及体外抗氧化活性评价：（1）用NaNO2––Al(NO3)3–NaOH法测定TFCM含量。（2）以维生素C、BHT为对照，测定还原力，清除DPPH自由基、· OH自由基、O2-自由基及H2O2的能力来评估体外抗氧化能力。
　　2. TFCM对鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响：将SH-SY5Y细胞分为正常组，模型组，TFCM低、中、高剂量组，TFCM低、中、高剂量组分别给予30、60、90mg/L剂量TFCM处理细胞，24h后与模型组同样用终浓度为20μM鱼藤酮作用24小时。用MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率。
　　3. TFCM对鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤相关基因表达及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响：将SH-SY5Y细胞分为正常组，模型组，TFCM低、中、高剂量组，TFCM低、中、高剂量组分别给予30、60、90mg/L剂量TFCM处理细胞，24h后与模型组同样用终浓度为20μM鱼藤酮作用24小时。黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测细胞中SOD活力，硫代巴比妥酸法（TBA）测细胞中MDA含量，定量分析降低的谷胱甘肽与氧化的谷胱甘肽的比值来测定GSH-Px的活力，免疫荧光法及 Western Blot法检测凋亡相关基因 Mcl-2、Cleaved caspase-3的表达。
　　结果：
　　1.（1）以芦丁作为标准对照，采用NaNO2––Al(NO3)3–NaOH法测得TFCM含量为81.19％。（2）体外抗氧化结果表明，在还原力测定试验中，还原力强弱顺序为TFCM　　2. TFCM对Rot诱导 SH-SY5Y损伤的影响：不同剂量鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞24h后，MTT法测细胞存活率，显示1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM处理组的细胞存活率分别为（75.20±4.29）%、（67.20±8.43）%、（63.40±8.15）%、（58.30±5.94）%、(50.50±5.85)%、(39.00±2.69)%，与正常组相比，细胞存活率显著降低，具有统计学差异（P<0.01），故选择终浓度20μM鱼藤酮处理构建SH-SY5Y细胞损伤模型。将SH-SY5Y细胞给予TFCM（60、90mg/L）处理24h后，用终浓度为20μM鱼藤酮作用24h，MTT法检测细胞存活率结果显示，TFCM给药组(60、90mg/L)与模型组比较，其存活率明显增高，且有剂量依赖性（P<0.05）；TUNEL法检测结果显示模型组TUNEL阳性细胞较多，凋亡率为（61.8±6.0）%，TFCM给药组（60、90mg/L）凋亡率分别为（28.2±8.0）%、（16.7±6.0）%，与模型组比较凋亡率显著降低（P<0.01），且均呈剂量依赖性。
　　3. SOD、GSH-Px活性和MDA含量检测结果显示：与正常组比较，模型组SOD、GSH-PX活性明显降低，MDA含量明显上升，具有统计学意义（P<0.01）；TFCM给药组（60、90mg/L）与模型组比较，SOD、GSH-Px活性明显升高，MDA含量明显下降(P<0.01或P<0.05)，呈剂量依赖性。Western Blot法检测显示，与正常组比较，模型组Mcl-1蛋白表达明显下降, Cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.01），具有统计学意义；与模型组比较，TFCM处理组（60、90mg/L） Mcl-1蛋白表达升高（P<0.05或P<0.01）, Cleaved caspase-3蛋白表达降低（P<0.05或P<0.01），且呈剂量依赖性。免疫荧光法检测结果表明：正常组细胞核形态规则, Mcl-1在细胞核核膜上有明显表达，CC3表达较低；经鱼藤酮处理后的模型组，细胞核形态不规则，Mcl-1表达水平呈明显降低，CC3在细胞核中有明显表达，与模型组比较，TFCM给药组（60、90mg/L）的Mcl-1表达水平逐渐上升，CC3表达水平逐渐降低，呈剂量依赖性。
　　结论：
　　1. TFCM有一定的的体外抗氧化活性。
　　2.在鱼藤酮诱导的细胞损伤模型中，TFCM增加损伤细胞存活率，降低细胞凋亡率，提示TFCM可抑制Rot诱导的SH-SY5Y细胞损伤。
　　3. TFCM抑制鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞的损伤，其机制可能是与氧化应激及上调凋亡相关基因Mcl-1、下调Cleaved caspase-3的表达有关。

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英文缩写对照

前言

第一部分 TFCM体外抗氧化活性研究

1.材料与仪器

2.方法

3. 结果

4.讨论

第二部分 TFCM对鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响

1.材料与仪器

2.方法

3.结果

四．讨论

第三部分 TFCM抗鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤机制的研究

1.材料与仪器

2.方法

3.结果

四．讨论

结论与展望

参考文献

致谢

综述:帕金森病氧化应激机制及抗氧化药物治疗进展

附录1 攻读硕士学位期间发表的论文