利用CRISPr-Cas9技术构建编码/非编码基因敲除体系

摘要

目的:
　　利用CRISPR-Cas9系统从基因组水平上分别敲除编码基因MKL1和长链非编码RNA HOTMR。为研究在宫颈癌中MKL1与HOTAIR的作用，构建二者缺失型HeLa细胞株，扩大该系统的应用范围。同时，利用这两种细胞体系验证MKL1和HOTAIR的细胞功能;建立二者与肿瘤抑制因子间的联系，为两者功能机制的研究提新出方向。
　　方法:
　　首先构建出稳定表达Cas9核酸酶的HeLa细胞株。其次，分别设计特异性靶向MKL1和HOTAIR基因的pgRNA引物，克隆其表达质粒，导入上述细胞株，构建相应的CRISPR-Cas9系统。细胞经药物筛选后，利用Western Blot蛋白分析和qRT-PCR定量分析分别确定MKL1和HOTAIR的敲除效率。通过MTT实验与细胞划痕实验检测目的基因缺失型HeLa细胞株增殖与迁移的变化。同时，提取这两类细胞株的RNA，qRT-PCR测定肿瘤抑制因子p21，p53，pRB以及DLC1转录水平的变化。其中针对MKL1对DLC1的调控进一步探究，利用生物信息学分析DLC1启动子序列，检测在HeLa细胞中过表达MKL1对DLC1表达水平的影响，同时构建启动子突变型荧光素酶报告基因质粒，配合ChIP实验验证MKL1对DLC1的调控作用。
　　结果:
　　利用稳定表达Cas9核酸酶的HeLa细胞株分别构建了靶定MKL1和HOTAIR基因的CRISPR-Cas9系统。Western Blot蛋白分析与qRT-PCR定量分析分别显示MKL1基本被敲除，而lncRNA HOTAIR表达只下调60％，未完全敲除。随后MTT实验表明MKL1缺失以及HOTAIR下调的HeLa细胞一周内增殖数量少于对照组;细胞划痕实验也显示这两类细胞的划痕愈合速度低于对照组。对于相关肿瘤抑制因子的影响，qRT-PCR检测显示MKL1缺失时，p53转录水平无明显变化，DLC1的下调80％，而p21与pRB上升1.5倍左右;HOTAIR下调时，DLC1和p53转录水平下调，而p21和pRB的转录水平明显上调。生物信息学分析得知DLC1上游1000bp启动子内含有两个CArG box序列;MKL1的过表达会上调DLC1的转录表达，同时ChIP实验和荧光素酶报告基因实验表明MKL1在DLC1启动子上有结合，且两个CArG box分别突变都会抑制DLC1的转录。
　　结论:
　　该实验在CRISPR-Cas9系统中应用pgRNA可显著敲除MKL1，而对lncRNAHOTAIR的敲除并不彻底，令其下调60％，具体原因还有待实验探究。此外，MKL1缺失及HOTMR下调皆可抑制HeLa细胞的增殖和迁移，并对不同肿瘤抑制因子的转录水平有不同的影响，暗示MKL1和HOTAIR可通过调控肿瘤抑制抑制参与细胞周期的调控，同时也为MKL1和HOTAIR新的作用机制研究提供了方向。如该实验研究发现MKL1可通过与DLC1启动子上的CArG box结合从而促进后者的转录表达。该实验结果表明了应用的pgRNA-Cas9系统敲除目的基因的应用价值与其局限性，而对于MKL1和HOTAIR对其他肿瘤抑制因子调控的具体机制，则有待在后续实验中进一步探究。

目录

声明

摘要

第1章 前言

第2章 实验材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 实验细胞

2．1．2 实验质粒

2．1．3 实验用化学试剂

2．1．4 细胞培养相关材料及试剂配制

2．1．5 核酸实验相关材料及试剂配制

2．1．6 Western Blot蛋白分析相关材料及试剂配制

2．1．7 质粒转染试剂配制

2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 sgRNA引物设计

2．3．2 sgRNA表达质粒构建

2．3．3 细胞培养

2．3．4 质粒转染及细胞筛选

2．3．5 单细胞克隆筛选及培养

2．3．6 基因组PCR检测

2．3．7 RNA水平检测

2．3．8 MTT检测

2．3．9 细胞划痕实验

2．3．10 蛋白分析

2．3．11 ChIP实验

2．3．12 荧光素酶报告基因实验

2．3．13 数据分析

第3章 结果

3．1 筛选稳定转染Cas9蛋白的HeLa细胞株

3．2 MKL1敲除及其对细胞功能的影响

3．2．2 MKL1在HeLa细胞中被敲除

3．2．3 MKL1的缺失抑制HeLa细胞的增殖与迁移

3．2．4 MKL1缺失调控相关肿瘤抑制因子的转录

3．2．5 过表达MKL1促进DLC1的转录

3．2．6 MKL1可与DLC1启动子上CArG box结合

3．3 HOTAIR下调及其对细胞功能的影响

3．3．1 构建靶定HOTAIR基因的sgRNA表达质粒

3．3．2 CRISPR-Cas9系统下调HOTAIR而非完全敲除

3．3．3 HOTAIR的下调使HeLa细胞的增殖与迁移下降

3．3．4 HOTAIR下调影响相关肿瘤抑制因子的转录

第4章 结论

第5章 讨论与展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

攻读硕士学位期间参加的科研项目