利用CRISPR-Cas9技术构建MSX1基因敲除人胚胎干细胞系

摘要

目的：
　　1.采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建与牙齿发育相关的MSX1基因敲除人胚胎干细胞（hESc）稳定细胞系。
　　2.研究MSX1基因敲除hESc系的多能性。
　　3.探讨MSX1基因敲除hESc的拟胚体（EB）向外、中、内三胚层细胞分化的能力。
　　方法：
　　1.采用分子克隆的技术构建pX330-MSX1KO-sgRNA载体、MSX1基因同源重组敲除载体(donor)。
　　2.将pX330-MSX1KO-sgRNA载体以及donor共同电转入hESc，PCR检测和测序鉴定鉴定存活的克隆。
　　3.对细胞进行形态学观察、染色体核型分析、流式细胞术，检测 MSX1基因双敲除hESc（H1-MSX1-DKO）的多能性。
　　4.体外形成H1-MSX1-DKO的拟胚体（EB），并诱导EB向外、中、内三胚层细胞分化，收集EB分化前后（D0和D8）细胞的总RNA，采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞三胚层细胞标记物的表达情况。
　　结果：
　　1.质粒测序结果显示pX330-MSX1KO-sgRNA载体以及 donor成功构建，并成功获得78株MSX1基因单敲除和2株MSX1基因双敲除hESc系（H1-MSX1-SKO, H1-MSX1-DKO）。
　　2. MSX1基因敲除hESc表现出典型的人胚胎干细胞的形态；另外，细胞除了保持原有正常核型外，还高表达多能性标记物OCT4和SSEA4。
　　3.实时荧光定量PCR结果显示分化D8的细胞外、中、内三胚层细胞标记物的表达水平都不同程度的高于未分化的细胞。
　　结论：
　　运用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够实现对人胚胎干细胞的特定的编辑；MSX1基因敲除hESc还能保持干细胞的多能性并向三胚层细胞分化。我们获得的MSX1基因敲除hESc可以用于进一步探讨牙齿发育的分子机制，进而为人类研究MSX1基因异常导致的先天缺牙等相关疾病的治疗提供一定参考。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 先天缺牙的研究现状

1.2 MSX1基因结构及其功能

1.3 CRISPR-Cas9基因编辑技术简介

1.4 CRISPR-Cas9基因编辑技术的推广运用

1.5 研究方法与研究目的

第2章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

第3章 实验结果

3.1 质粒的构建

3.2 Cas9切割效率检测实验

3.3 MSX1基因敲除hESc系的构建及鉴定

3.4 H1-MSX1-DKO细胞系鉴定

3.5 H1-MSX1-DKO细胞分化能力检测

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 进一步研究计划

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:MSX1基因与先天缺牙关系的研究进展