褐藻多酚Eckol抗肿瘤作用及机制研究

摘要

目的:
　　观察褐藻多酚Eckol的抗肿瘤作用，并探讨其可能的作用机制，为Eckol在肿瘤防治中的应用提供实验依据。
　　方法:
　　1、Eckol的抗肿瘤作用研究:分别建立移植型S180腹水瘤及肉瘤荷瘤小鼠模型，造模前预防性给予生理盐水或Eckol(0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)7天。S180腹水瘤小鼠模型造模后继续给药15天，每天记录小鼠活动状态，记录小鼠生存天数。S180肉瘤荷瘤小鼠模型造模后继续给药10天，每天记录小鼠体重，记录小鼠生长曲线，最后一次给药1h后，处死小鼠，分离脾脏和胸腺，计算脾指数和胸腺指数;剥取肉瘤组织，称重;HE染色观察肿瘤组织病理变化;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡;以Western blot法测定瘤组织EGFR、Bcl-2、Caspase-3的表达水平。
　　2、Eckol对S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能的影响:建立移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型，造模前预防性给药7天，造模后继续给药10天。取小鼠外周血血清，ELISA法检测IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β的水平;以碳粒廓清法了解小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能;取外周血，流式细胞术测定小鼠外周血T细胞亚群分布;分离小鼠脾脏，磨碎后过滤、种板，ConA诱导脾细胞转化，MTT法检测Eckol对脾细胞转化的影响;免疫组化法测定CD11c阳性细胞在肿瘤组织中的分布，了解肿瘤组织树突状细胞浸润情况;从小鼠骨髓中获得小鼠骨髓来源的单核细胞，用含IL-4和GM-CSF20ng/ml的RPMI1640培养基培养7天，诱导分化为树突状细胞。收集细胞，流式三标法(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)检测髓源性树突状细胞表型。
　　3、Eckol对Reg3A诱导人胰腺癌SW1990细胞过度增殖的影响:体外培养SW1990细胞，Eckol（0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）处理细胞48h，加入50ng/ml的外源性Reg3A蛋白共处理24h后，MTT法检测细胞存活率。选取Eckol（5、10、20μg/ml）三个浓度组，Eckol处理细胞48h后，50ng/ml外源性Reg3A蛋白共处理24h，流式细胞术测定细胞周期;软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Real Time PCR法检测JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA表达;Western blot法检测JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、NF-κB、Cyclin D1蛋白水平表达。
　　结果：
　　1、Eckol的抗肿瘤效应:Eckol体内干预可延长移植型S180腹水瘤荷瘤小鼠生存天数;移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型中，Eckol呈剂量依赖性地降低肉瘤重量，升高脾指数，且不明显改变动物生存曲线。肿瘤组织HE染色结果显示，Eckol处理组中，肉瘤组织微血管减少，坏死增加，核固缩明显，癌巢周围发现单核细胞浸润。TUNEL染色结果显示，Eckol处理组肿瘤细胞凋亡增加。肿瘤组织内凋亡蛋白Caspase-3表达上升，抑凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白EGFR表达下降。提示Eckol体内抗肿瘤效应明显。
　　2、Eckol对移植型S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能具有显著调节作用:ELISA结果显示，Eckol处理组S180肉瘤荷瘤小鼠血清中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ显著升高，提示Eckol能够调节Th1/Th2平衡，促进Th1介导的细胞免疫;此外，Eckol提高荷瘤小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能，促进脾淋巴细胞转化，调节外周血T细胞亚群比例。免疫组化及流式结果显示，Eckol能够促进肿瘤组织树突状细胞的浸润，且影响树突状细胞表型，促进髓源性树突状细胞成熟。提示，Eckol体内抗肿瘤效应极可能与其对荷瘤小鼠的免疫功能的调节作用相关。
　　3、Eckol对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖的抑制作用:MTT法显示，5-20μg/ml Eckol对SW1990细胞增殖没有明显的体外抑制作用，但Eckol+Reg3A与Reg3A单独作用相比，细胞存活率下降。细胞周期检测发现，与Reg3A单独作用相比，Eckol+Reg3A组S期和G2/M期细胞减少，G0/G1期细胞增多。软琼脂克隆形成实验结果显示，Eckol+Reg3A组的克隆数比Reg3A组克隆数明显减少。Real Time PCR和Western blot结果发现，Reg3A可以上调JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA及蛋白的表达水平，而Eckol可浓度依赖性地抑制这些上调作用。提示，Eckol体外对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖具有抑制作用，其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
　　结论：
　　1、Eckol具有显著抗肿瘤效应，其体内抗肿瘤效应的发挥可能与其调节荷瘤小鼠免疫功能密切相关。
　　2、Eckol体外可抑制胰腺炎症相关介质Reg3A蛋白诱导的胰腺癌SW1990细胞过度增殖，提示Eckol对伴随炎症的胰腺癌的恶性进展具有潜在的抑制效应，其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。

目录

声明

摘要

1 前言

2 实验材料

2．1 实验动物及细胞系

2．2 试剂

2．3 仪器

3 实验方法

3．1 S180细胞培养

3．2 移植型S180腹水瘤小鼠荷瘤模型的建立及干预

3．3 移植型S180肉瘤小鼠荷瘤模型的建立及干预

3．4 石蜡切片及HE染色

3．5 TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡

3．6 Western Blot检测

4 统计学分析

5 结果

5．2 Eckol对移植型S180肉瘤荷瘤小鼠的保护作用

5．3 Eckol对肿瘤组织病理的影响

5．4 Eckol促进肿瘤细胞凋亡

5．5 Eckol对细胞增殖及凋亡相关分子表达的影响

6 讨论

7 小结

第二部分 Eckol体内调节荷瘤小鼠免疫功能

1 前言

2 实验材料

2．1 实验动物及细胞系

2．2 试剂

2．3 仪器

3 实验方法

3．1 移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型的建立

3．2 ELISA法

3．3 碳粒廓清法

3．4 脾淋巴细胞增殖实验

3．6 免疫组化法检测肿瘤组织DCs浸润

3．7 髓源性DCs表型检测

4 统计学分析

5 结果

5．2 Eckol提高移植型S180肉瘤荷瘤小鼠外周血单核-吞噬细胞功能

5．3 Eckol促进移植型S180肉瘤荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化

5．4 Eckol提高移植型S180肉瘤荷瘤小鼠外周血CD4+T细胞比率

5．5 Eckol促进肿瘤组织DCs的浸润

5．6 Eckol促进荷瘤小鼠髓源性DCs成熟

6 讨论

7 小结

第三部分 Eckol抑制胰腺炎症相关因子Re93A诱导的人胰腺癌SW1990细胞过度增殖

1 前言

2 实验材料

2．1 细胞株

2．2 试剂

2．3 仪器

3 实验方法

3．1 MTT法

3．2 细胞周期检测

3．3 软琼脂克隆形成实验

3．4 Real Time PCR检测

3．5 Western blot检测

4 统计学分析

5 结果

5．3 Eckol抑制Re93A诱导的SW1990细胞软琼脂克隆的形成

5．4 Eckol对Re93A诱导的SW1990细胞过度增殖的保护作用可能与JAK2／STAT3通路和NF-κKB／CyclinD1通路相关

6 讨论

7 小结

结论

参考文献

综述 基于树突状细胞的免疫疗法在胰腺癌治疗中的应用

致谢

附录