红松球果多酚类化合物分离鉴定及抗肿瘤作用机制研究

摘要

肿瘤是威胁人类健康的杀手，目前常规治疗肿瘤的化学药物对患者正常组织器官均有不同程度的毒性，给机体带来新的健康隐患。免疫系统在肿瘤发生发展中扮演重要的角色。然而，肿瘤细胞的增殖生长不仅能够降低免疫细胞的反应性，还能诱导免疫细胞凋亡从而抑制其抗肿瘤活性。因此，寻找提升机体免疫活性且安全有效的天然抗肿瘤化合物成为科研热点。本论文以红松球果多酚（polyphenols of Pinus koraiensis pinecone）为研究对象，采用超声波辅助提取技术从红松球果中萃取活性多酚类化合物，对其分离纯化工艺进行优化研究；通过体外抗肿瘤活性跟踪，筛选出抗肿瘤活性最强的40%乙醇洗脱组分（PPP-40），并对其主要组成成分进行分析；系统地研究PPP-40体内体外抗肿瘤作用途径并揭示其对S180肿瘤小鼠免疫系统损伤的修复机制。
　　采用超声波技术提取红松球果多酚类物质。以多酚提取率为考察指标优化多酚提取工艺：在料液比1:20，乙醇浓度60%，超声功率400 W及超声时间60 min工艺条件下获得的多酚提取率最高为19.02±0.67 mg/g。AB-8大孔树脂层析结合响应面优化多酚纯化工艺，获得一级分离组分PPP纯度为27.93±1.40%。D101大孔树脂二级乙醇梯度分离 PPP，获得二级分离组分 PPP-40具有最高多酚纯度（57.25±1.83%），且抗人结肠癌（LOVO）细胞增殖活性最强（EC500.21±0.03 mg/mL），表明此分离纯化手段能够有效地提高红松球果多酚抗肿瘤活性。
　　采用超高效液相-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱仪（UPLC-Q-TOF-MS）对PPP-40活性成分进行分析。PPP-40主要由11种多酚化合物组成，分别为咖啡酸、甲氧基香豆素、儿茶素、4,6,7-三甲氧基-5-甲基香豆素、紫草酸、花旗松素、7-木糖-葛根素、鼠李素、异鼠李素、5-O-甲基槲皮素及3-O-甲基槲皮素。
　　PPP-40体外抗肿瘤作用途径及机制研究发现，PPP-40能够显著地抑制LOVO细胞克隆形成，诱导其 DNA损伤，促使细胞发生凋亡。对其凋亡机制研究发现， PPP-40是通过降低细胞线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP），减少三磷酸腺苷（Adenosine5’-Triphosphate, ATP）合成量，升高活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平，从而导致LOVO细胞线粒体功能障碍。与此同时， PPP-40促进了LOVO细胞线粒体细胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）的释放，相应激活细胞凋亡相关半胱天冬酶（Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9），进而诱发细胞发生Caspases依赖式凋亡。
　　PPP-40体内抗肿瘤作用途径及机制研究。PPP-40中剂量（150 mg/kg）对S180荷瘤小鼠具有最高的抑瘤率（48.29%），它是通过上调肿瘤细胞线粒体凋亡蛋白（Bax及Caspase-3）表达量及下调Bcl-2抗凋亡蛋白表达水平而诱导S180小鼠体内肿瘤细胞凋亡。
　　肿瘤的存在及肿瘤微环境的影响会造成机体免疫系统损伤及抗氧化防御系统失衡。因此，实验进一步揭示PPP-40对机体受损系统的修复影响。结果发现，PPP-40能够显著地增加S180小鼠脾脏指数，促进T淋巴细胞转化，抑制脾淋巴细胞周期阻滞(G0/G1期）及凋亡；也能够有效地提高 T淋巴细胞亚群 CD3+CD4+及CD3+CD8+比例，相应地增加脾淋巴细胞免疫因子白介素-2（IL-2）、白介素-12（IL-12）及肿瘤坏死因子（TNF-α）释放水平。PPP-40最终是通过调节Bax及Bcl-2蛋白表达量，下调线粒体凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3表达；另外，PPP-40也可以通过抑制Fas、Caspase-8及Caspase-3蛋白的表达从而抑制死亡受体凋亡途径。研究发现PPP-40在发挥抗肿瘤作用的同时，能够有效的修复S180荷瘤小鼠受损的免疫系统。最后，对S180小鼠脾脏及肝脏抗氧化酶系的表达及抗氧化物质合成能力分析，PPP-40能够有效的调节肿瘤微环境造成的体内氧化还原失衡。本研究揭示了PPP-40抗肿瘤的作用机制，对于进一步开发天然抗肿瘤多酚类物质具有一定的理论价值及指导意义。

目录

第1章 绪论

1.1 课题背景及研究的目的意义

1.2植物多酚类化合物的研究进展

1.3 植物多酚类化合物的抗肿瘤机制

1.4 植物多酚类化合物抗肿瘤研究进展

1.5 松属植物活性成分与生理功能研究进展

1.6 主要研究内容

第2章 材料与方法

2.1 实验材料与仪器

2.2 红松球果多酚超声波提取工艺优化

2.3 总多酚的测定

2.4红松球果多酚纯化工艺优化

2.5 PPP-40主要活性成分分析

2.6红松球果多酚体外抗肿瘤作用研究

2.7红松球果多酚体内抗肿瘤作用研究

2.8数据的统计分析

第3章 红松球果多酚类化合物分离纯化及结构鉴定

3.1 引言

3.2 红松球果多酚超声波提取参数优化

3.3响应面优化红松球果多酚纯化工艺

3.4多酚二级分离组分纯度比较

3.5 红松球果多酚体外抗肿瘤增殖活性跟踪

3.6 红松球果多酚PPP-40组成成分分析

3.7本章小结

第4章 红松球果多酚PPP-40体外抗肿瘤机制研究

4.1 引言

4.2 PPP-40体外抗肿瘤机制研究

4.3PPP-40诱发肿瘤LOVO细胞凋亡的作用机制

4.4本章小结

第5章 红松球果多酚PPP-40体内抗肿瘤机制研究

5.1 引言

5.2 PPP-40对S180荷瘤小鼠体重变化的影响

5.3 PPP-40对S180实体瘤生长的抑制作用

5.4 PPP-40对S180小鼠肿瘤细胞凋亡的影响

5.5 PPP-40对S180小鼠肿瘤细胞凋亡相关蛋白表达的影响

5.7 PPP-40对S180小鼠对体内MDA及相关抗氧酶系的影响

5.8 PPP-40对S180小鼠体内抗肿瘤的作用机制

5.9本章小结

结论

创新点

展望

参考文献

附录一

附录二

附录三

附录四

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢

个人简历