一种具有抗肿瘤作用的化香果多酚提取物及其制备方法

摘要

本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的化香果多酚提取物及其制备方法。以化香树果序为原料，经脱脂、提取、萃取、干燥得到化香果多酚提取物（见图1）。本发明制备的化香果多酚提取物颜色浅，纯度高，对肿瘤细胞生长具有显著抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的化香果多酚提取物及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见疾病，在我国城市人口中，肿瘤是第一位死因，占全部死亡率的四分之一，肿瘤亦是当今医学界的一大难题。在恶性肿瘤的三大疗法中，药物治疗占有重要的地位，发展速度也最快，合成的化学类抑肿瘤药物绝大多数是以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物，抗癌、抗肿瘤药物的开发，包括计算机模拟和仿生设计都是以天然抗癌、抗肿瘤活性成分为基础的。为了应对癌症给人类健康所造成的巨大威胁，世界各国恶性肿瘤药物开发者们尤为重视植物中具有抗肿瘤活性的天然化合物。因此，从各种植物中筛选安全、高效、低毒的天然抗肿瘤活性成分单体或组分成为近年来国内外科学家研究的重点课题。

化香树果序为胡桃科植物化香树（Plotytarya strohilacea Sieb et Zuce）的干燥果序，果序球果状，卵状椭圆形至长椭圆状圆柱形，长2.5～5 cm，直径2～3 cm，包片宿存，大质，褐色；小坚果扁平，两侧具狭翅。种子卵形，种皮膜质。我国西北、华东、华中、华南等地均出产。化香树在我国民间的应用广且历史悠久，多以叶、果序入药。化香树果序具有清热解毒．散风止痛，活血化瘀、通窍排脓的功效，主要用于鼻渊、头痛、内伤胸胀、腹痛、筋骨疼痛、痈肿、疥癣等病症。化香果序中含有较丰富的多酚类化合物，其所具有的特殊的生物学和药理学活性是其药用价值的基础。因此，开展化香果序多酚的提取制备和生物活性研究，对更好的开发利用化香果序资源，具有重要的指导意义。已知的国内外文献对化香果序提取物及药理活性的研究，多集中在化香树及其果序提取物对细胞毒性、肠道内有害菌的抑制作用、抗氧化作用，以及化香树作为复方中药治疗急慢性鼻炎、鼻窦炎的报道，但对化香树果序多酚提取物抗肿瘤活性的研究与开发尚属空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤作用的化香果多酚提取物及其制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提出的化香果多酚提取物的制备方法，包括如下步骤：

（1）以干燥、粉碎的化香树果序为原料，按质量体积比1 g : 2.5 mL～1 g : 3.0 mL加入石油醚溶液室温浸提1～10 h脱脂处理。过滤，滤渣室温晾干或40～50℃烘干；

（2）经脱脂处理过的化香树果序原料按质量体积比1 g : 2 mL～1 g : 5 mL加入1%～100%甲醇溶液，常温或加热提取，或利用常压回流提取装置提取，或微波或超声辅助提取1～5次，每次10 min～10 h，过滤，滤液合并。于40～60°C下减压蒸发除去甲醇溶剂，水相经冷冻干燥得粗提物；

（3）粗提物按质量体积比1 g : 5 mL～1 g : 10 mL加入纯水，搅拌溶解，加入同体积乙酸乙酯萃取1～5次，分离，得乙酸乙酯萃取相和水相；

（4）乙酸乙酯萃取相减压蒸发除去溶剂，经冷冻干燥得到浅黄色化香果多酚提取物。

优选的是：提取用甲醇水溶液的体积百分浓度为70%。

提取次数最好为3次。

采用Folin-Ciocalteu法测定化香果多酚提取物中总酚含量，本发明制备的化香果多酚提取物中总酚含量为68%～72.5%。化香果多酚提取物经LC-MS进行化学成分鉴定，其LC-MS谱图见图2。经分析鉴定表明，本发明所制备的化香果多酚提取物中主要成分为：鞣花酸, 二-六羟基二苯甲酰基-吡喃(型)葡萄糖（bis-HHDP-glucopyranose），3, 4, 5-三羟苯甲酰-二-六羟基二苯甲酰基-吡喃(型)葡萄糖（galloyl-bis-HHDP-glucopyranose），三没食子酰基-六羟基二苯甲酰基-吡喃(型)葡萄糖（trigalloy-HHDP-glucopyranose），五没食子酰葡萄糖（penta-galloyl-glucopyranose），二没食子酰基-二-六羟基二苯甲酰基-吡喃(型)葡萄糖（digalloyl-bis-HHDP-glucopyranose）等多酚化合物。

本发明制备的化香果多酚提取物具有颜色浅、纯度高，制备方法工艺简单等特点。

化香果多酚提取物体外抗肿瘤活性试验结果显示：化香果多酚提取物与对照组相比对非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人神经母细胞瘤细胞SH-SY-5Y、人结肠癌细胞HCT116、骨肉瘤细胞U2Os-NKFB的生长具有显著抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

 附图说明

图1为化香果多酚提取物的制备流程图；

图2为化香果多酚提取物化学成分LC-MS分析色谱图。

 具体实施方式

参考下列实施例将更容易、更全面地理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1

（1）以150 g化香树果序为原料，干燥、粉碎后，加入400 mL石油醚溶液室温浸提10 h脱脂处理。过滤，滤渣45℃烘干；

（2）经脱脂处理过的化香树果序原料加入400 mL 70%甲醇溶液，40°C水浴提取3次，每次1 h，过滤，滤液合并。滤液于40°C下减压旋转蒸发除去甲醇溶剂，水相经冷冻干燥得粗提物14.6 g；

（3）粗提物分散于100 mL的纯水中，加入同体积乙酸乙酯萃取3次，分离，得乙酸乙酯萃取相和水相；

（4）将乙酸乙酯萃取相减压蒸发除去溶剂，经冷冻干燥得到浅黄色化香果多酚提取物3.42 g。

 实施例2

（1） 以120 g化香树果序为原料，干燥、粉碎后，加入300 mL石油醚溶液室温浸提4 h脱脂处理。过滤，滤渣45℃烘干；

（2）经脱脂处理过的化香树果序原料加入400 mL 80%甲醇溶液，45°C水浴提取3次，每次1 h，过滤，滤液合并。滤液于50°C下减压旋转蒸发除去甲醇溶剂，水相经冷冻干燥得粗提物；

（3）粗提物分散于100 mL的纯水中，加入同体积乙酸乙酯萃取3次，分离，得乙酸乙酯萃取相和水相；

（4）将乙酸乙酯萃取相减压蒸发除去溶剂，经冷冻干燥得到浅黄色化香果多酚提取物1.91 g。

 实施例3

（1）以200 g化香树果序为原料，干燥、粉碎后，加入400 mL石油醚溶液室温浸提2 h脱脂处理。过滤，滤渣室温晾干；

（2）经脱脂处理过的化香树果序原料加入700 mL 60%甲醇溶液，40°C水浴提取3次，每次1 h，过滤，滤液合并。滤液于50°C下减压旋转蒸发除去甲醇溶剂，水相经冷冻干燥得粗提物；

（3）粗提物分散于100 mL的纯水中，加入同体积乙酸乙酯萃取3次，分离，得乙酸乙酯萃取相和水相；

（4）将乙酸乙酯萃取相减压蒸发除去溶剂，经冷冻干燥得到浅黄色化香果多酚提取物4.10 g。

 实施例4 化香果多酚提取物抗肿瘤实验研究

（一）实验材料和药物

（1）供试药物的制备：本发明实施例1所制备的化香果多酚提取物采用磷酸盐缓冲液PBS溶解为浓度 1 mg/mL的母液，贮存于4℃冰箱。实验前用细胞培养液稀释配制成所需浓度。

（2）肿瘤细胞株的选用与培养：肿瘤细胞株选用非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人神经母细胞瘤细胞SH-SY-5Y、人结肠癌细胞HCT116、骨肉瘤细胞U2Os-NKFB。DMEM培养基、5A培养基用超纯水配成细胞培养液。每升细胞培养液中含有DMEM培养基、5A培养基10.4 g，Hepes 4.8 g，NaHCO₃ 2.4 g，青霉素、链霉素各100 mg，pH 7.2，用0.22 μm滤膜过滤除菌后，分装，4℃冰箱保存备用。临用前加入小牛血清，使其终浓度为10%。

（二）实验方法

采用MTT法测定细胞毒性：非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人神经母细胞瘤细胞SH-SY-5Y、骨肉瘤细胞U2Os-NKFB分别加入DMEM培养液和10 μM谷氨酰胺，人结肠癌细胞HCT116加入5A培养液，在37℃、5%CO₂饱和湿度的培养箱中常规培养。48 h更换培养液，细胞汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。收集对数生长期细胞，台盼蓝拒染法表明细胞活力＞95%，将细胞制成5×10⁴/mL悬液，接种至96孔培养板内，每孔200 μL，细胞贴壁后给药。实验分别设溶剂对照组和给药组，每组6孔，给药组用细胞培养液稀释配制成所需浓度的化香果多酚提取物作用24 h后，每孔加5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h，吸去上清液，每孔加DMSO 200 μL，充分振荡混匀后用酶联免疫检测仪在570 nm处测定各孔的吸光度（OD_570nm），实验重复3次，取平均值。计算药物对细胞生长的抑制率和IC₅₀。抑制率（%）=（1-OD_给药组/OD_对照组）×100。

（三）实验结果

（1）化香果多酚提取物对非小细胞肺癌细胞A549生长的抑制作用

化香果多酚提取物对非小细胞肺癌细胞A549半数生长浓度IC₅₀为40.1 μg/mL，各浓度药物对非小细胞肺癌细胞A549生长均表现出显著的抑制作用（见表1）。

表1化香果多酚提取物对非小细胞肺癌细胞A549的生长抑制作用

平均数±SD，n=3，24 h。^*P<0.05，^**P<0.01, 与对照组相比较。

 （2） 化香果多酚提取物对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用

化香果多酚提取物对人肝癌细胞HepG2半数生长浓度IC₅₀为42.6 μg/mL，各浓度药物对人肝癌细胞HepG2生长均表现出显著的抑制作用（见表2）。

表2化香果多酚提取物对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用

平均数±SD，n=3，24 h。^*P<0.05，^**P<0.01, 与对照组相比较。

 （3）化香果多酚提取物对人神经母细胞瘤细胞SH-SY-5Y生长的抑制作用

化香果多酚提取物对人神经母细胞瘤细胞SH-SY-5Y半数生长浓度IC₅₀为77.4 μg/mL，供试药物各浓度对人神经母细胞瘤细胞SH-SY-5Y生长表现出显著的抑制作用（见表3）。

表3化香果多酚提取物对人神经母细胞瘤细胞SH-SY-5Y的生长抑制作用

平均数±SD，n=3，24 h。^*P<0.05，^**P<0.01, 与对照组相比较。

 （4）化香果多酚提取物对人结肠癌细胞HCT116生长的抑制作用

化香果多酚提取物对人结肠癌细胞HCT116半数生长浓度IC₅₀为40.1 μg/mL，供试药物各浓度对人结肠癌细胞HCT116生长表现出显著的抑制作用（见表4）。

表4化香果多酚提取物对人结肠癌细胞HCT116的生长抑制作用

 

 平均数±SD，n=3，24 h。^*P<0.05，^**P<0.01, 与对照组相比较。

（5）化香果多酚提取物对骨肉瘤细胞U2Os-NKFB生长的抑制作用

化香果多酚提取物对骨肉瘤细胞U2Os-NKB半数生长浓度IC₅₀为40.1 μg/mL，供试药物各浓度对骨肉瘤细胞U2Os-NKFB生长表现出显著的抑制作用（见表5）。

表5化香果多酚提取物对骨肉瘤细胞U2Os-NKFB的生长抑制作用

 平均数±SD，n=3，24 h。^*P<0.05，^**P<0.01, 与对照组相比较。

通过以上表1至表5可见，化香果多酚提取物对非小细胞肺癌细胞、人肝癌细胞、人神经母细胞瘤细胞、人结肠癌细胞、骨肉瘤细胞都具有很好的抑制作用，因此可以用于制备抗肿瘤的药物。