重组单纯疱疹病毒的溶瘤机制及其对非允许细胞NIH3T3感染的研究

摘要

曾经报道构建了一株大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)基因插入凋亡抑制基因(神经毒基因)icp34.5位点使之失活的选择性复制的重组单纯疱疹病毒mtHSV，它能选择性地杀死肿瘤细胞，而不杀死正常细胞。mtHSV的这种选择性溶瘤效果，在多种肿瘤细胞系和瘤内注射的荷Hcp3B的裸鼠模型上得到了证实，然而，它的溶瘤机制尚未确定。 Farassati F.等研究证明，HSV-1易感染转染了癌基因v erbB、激活了sos或者ras基因的NIH3T3细胞。这意味着HSV-1通过Ras信号途径进入细胞。以前的研究表明RTN家族中的个重要成员RTN3(RTN3即HAP，ASYIP，ASY的同源相互作用蛋白)是内质网应激反应的靶基因，过表达的RTN3能导致内质网超载反应。以前的研究也显示RTN3的一个重要特征是它定位在内质网上，但是关于RTN3与Ras的关系以及与mtHSV感染Hela细胞的关系尚未见报道。 在本研究中，着眼于研究mtHSV选择性溶瘤的分子机制，即mtHSV侵染Hela细胞与Ras和RTN3的关系。研究表明，HeLa细胞能被mtHSV有效杀死。流式细胞术和Western blot实验表明，mtHSV感染HeLa细胞48小时后，随着内质网中RTN3蛋白上调，细胞质膜上的Ras蛋白明显下调，而细胞中的Ras蛋白总量没有变化。用人法尼基转移酶的α亚基的siRNA抑制剂siFTa和RTN3的siRNA抑制剂siRTN3分别转染HeLa细胞48小时后，细胞质膜上的Ras蛋白和细胞中的Ras蛋白总量分别被下调，siFTa和siRTN3能有效地杀死HeLa细胞，有效地抑制mtHSV感染HeLa细胞。进一步用激光共聚焦和免疫共沉淀实验研究了Ras和RTN3的关系。研究结果表明:Ras和RTN3能在内质网上相互作用，Ras/RTN3是mtHSV侵染HeLa细胞的一个重要因素。Ras和RTN3分子间的相互作用进一步提升了对Ras和RTN3在mtHSV感染HeLa细胞过程中功能的理解。 为了进一步研究mtHSV侵染Hela细胞与P53以及细胞凋亡的关系，分别用流式细胞术和Western blot方法检测了P53蛋白的表达。结果表明:mtHSV感染He la细胞后24h，P53蛋白的表达无明显变化。DNA ladder分析、Hoechst33258染色观察、AnnexinV/PI双染法检测表明:mtHSV不诱导Hela细胞早期凋亡。在Hela细胞中，p53基因序列正常，HPV-16被整合到Hela细胞中，P53蛋白功能失常，因此mtHSV不诱导Hela细胞早期凋亡。上述结果表明:mtHSV引起Hela细胞死亡与P53无关，mtHSV通过裂解细胞导致Hela细胞死亡。 为了进一发现mtHSV进入细胞的入口，以便透彻理解mtHSV侵染细胞的分子机制。用mtHSV去筛选噬菌体十五肽文库，经过四轮淘洗，筛选到一个特异性很强的十五肽片段。经推断出的氨基酸序列APFSRLLFPDFRSFV与RasGRP2具有84％的同源性。构建了重组质粒AcBacmid-RasGRP2和重组AcNPVvAc-RasGRP2，在昆虫Sf9细胞中表达了RasGRP2蛋白，表达的蛋白分子量约为68KD。生物软件“DAS”Transmembrane Prediction server对RasGRP2蛋白的跨膜区预测结果表明:RasGRP2蛋白是跨膜蛋白，RasGRP2蛋白297314处连续有18个疏水氨基酸(LGVHLKDLVALQLALPDW)，为RasGRP2蛋白的跨膜区。 为了确定mtHSV的相互作用蛋白RasGRP2在mtHSV和HSV-1感染细胞过程中的作用，构建了能表达RasGRP2蛋白的真核表达载体pAdtrackCMVRasGRP2，以gfp作（绿色荧光蛋白)作为报道基因，以确定RasGRP2蛋白存细胞中的表达。用pAdtrackCMV RasGRP2转染mtHSV和HSV-1的非允许细胞系NIH3T348小时后，分别用mtHSV和HSV-1感染NIH3T3细胞。病毒吸附感染实验结果表明:表达RasGRP2蛋白的NIH3T3细胞可以被mtHSV和HSV-1感染。Stone JC等报道:RasGRP2位于Ras信号通路上且位于Ras的上游，关于mtHSV的相互作用蛋白RasGRP2介导mtHSV和HSV-1对非允许细胞NIH3T3感染的研究结果同时证明了，RasGRP2是mtHSV和HSV-1进入细胞的新的入口,Ras信号途径是mtHSV进入细胞的重要门户。上述研究结果将为mtHSV用于癌症治疗提供理论依据。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章单纯疱疹病毒与单纯疱疹病毒载体

1．1．单纯疱疹病毒的生物学特性

1．2单纯疱疹病毒载体

1．2．1非复制型单纯疱疹病毒载体

1．2．2复制型单纯疱疹病毒载体(溶瘤病毒载体)

1．2．3单纯疱疹病毒载体的应用

第二章溶瘤病毒与肿瘤基因治疗

2．1肿瘤基因治疗概述

2．2溶瘤病毒(复制型病毒载体)

2．2．2理想的溶瘤病毒特征及来源

2．2．3溶瘤病毒杀灭肿瘤细胞的一般机制

2．2．4溶瘤病毒特异性增殖的机制

2．2．5溶瘤病毒抗癌特异性

2．2．6病毒溶瘤作用产生的免疫反应

2．2．7溶瘤病毒技术进展

2．2．8常见的几种溶瘤病毒及应用

2．3结语

第三章本研究的已有基础以及研究目的和意义

3．1关于mtHSV的研究成果

3．1．1关于mtHSV的构建以及细胞和小鼠水平的杀瘤效应

3．1．2关于mtHSV对荷人肝癌Hep-3B裸鼠的杀瘤实验

3．2关于腺病毒的研究成果

3．2．1关于非复制型腺病毒的研究成果

3．2．2关于复制型腺病毒的研究成果

3．3本研究的目的和意义

第四章Ras/RTN3介导mtHSV侵染HeLa细胞

4．1前言

4．2．材料和方法

4．2．1病毒、菌株、细胞、和试剂

4．2．2载体

4．2．3细胞培养

4．2．4细胞冻存

4．2．5细胞复苏

4．2．6质粒DNA的制备

4．2．7低熔点琼脂糖凝胶法回收DNA片段

4．2．8DNA操作

4．2．9菌种的保存

4．2．10菌落PCR

4．2．12亚细胞组分的制备：从细胞中分离细胞质膜及内质网组分

4．2．13人法尼基转移酶(FTase)siRNA靶序列的选择

4．2．14 MTT分析

4．2．15细胞表面蛋白的流式细胞术定量检测

4．2．16激光共聚焦荧光定位

4．2．17免疫共沉淀

4．2．18 Western blot分析

4．2．19抗体的制备

4．2．20免疫荧光分析

4．2．21统计学分析

4．3研究结果

4．3．1载体的构建

4．3．2 mtHSV能有效杀死Hela细胞

4．3．3 mtHSV感染的Hela细胞中Ras和RTN3的表达

4．3．4 mtHSV感染Hela细胞后Ras和RTN3在细胞质膜和内质网上的表达

4．3．5 Ras和RTN3蛋白的共定位

4．3．6 Ras和RTN3蛋白的相互作用

4．3．7 siRNA沉默了Hela细胞中Ras和RTN3蛋白的表达

4．3．8 siFTa and siRTN3能有效的杀死Hela细胞

4．3．9 siFTa and siRTN3有效抑制了mtHSV对Hela细胞的侵染

4．4讨论

第五章mtHSV引起HeLa细胞死亡：凋亡?裂解?

5．1前言

5．2材料和方法

5．2．1病毒、菌株、细胞和试剂

5．2．2细胞培养

5．2．3细胞冻存

5．2．4细胞复苏

5．2．5 Hoechst 33258染色

5．2．6 DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析

5．2．7 Annexin V/PI双染法

5．2．8细胞表面蛋白的流式细胞术定量检测

5．2．9 Western blot分析

5．2．10激光共聚焦蛋白质免疫荧光定位

5．2．11统计学分析

5．3研究结果

5．3．1 mtHSV感染Hela细胞后P53蛋白的表达

5．3．2 mtHSV感染后P53蛋白在Hela和Hep3B细胞内的定位

5．3．3 mtHSV感染Hela细胞不诱发Hela细胞核形态改变

5．3．4 mtHSV感染Hela细胞不诱发Hela细胞DNA片断化

5．3．5流式细胞术(Annexin V/PI双染)检测结果

5．4讨论

第六章重组单纯疱疹病毒相互作用蛋白RasGRP2的筛选、表达及其功能鉴定

6．1前言

6．2材料与方法

6．2．1病毒、菌株、细胞、和试剂

6．2．2文库

6．2．3病毒的增殖、分离和提纯

6．2．4噬菌体文库筛选

6．2．5 PCR

6．2．6质粒DNA的制备

6．2．8重组质粒的构建

6．2．9重组质粒DNA的转座

6．2．10重组Bacmid DNA(＞100 kb)的提取与制备

6．2．11 RasGRP2的真核表达及纯化

6．2．12 SDS-PAGE电泳

6．2．13 Western blot分析

6．2．14 DNA操作

6．2．15细胞培养

6．2．16质粒DNA转染

6．2．17 RasGRP2蛋白的跨膜区预测

6．2．18病毒吸附感染

6．3研究结果

6．3．1病毒的增殖、分离和提纯

6．3．2重组单纯疱疹病毒相互作用蛋白的筛选与鉴定

6．3．3载体和重组杆状病毒的构建

6．3．4 RasGRP2蛋白的表达

6．3．5 RasGRP2蛋白的跨膜区预测结果

6．3．6转染pAdtrackCMV RasGRP2的NIH3T3细胞可以被mtHSV和HSV-1感染

6．4讨论

研究总结

本文的创新点

参考文献

攻读博士学位期间发表和待发表的文章

致谢