ROS和DNA--PKcs/Akt信号通路在氢醌诱导K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用

摘要

目前普遍认为，苯的代谢产物，而不是苯自身，介导了苯对造血细胞的多种生物学作用，产生骨髓毒性。苯的醌类代谢产物—氢醌暴露可诱导细胞损伤和细胞凋亡。 近来研究表明，DNA-PKcs是一个重要的损伤修复基因，在DNA双链断裂的非同源末端连接(NHEJ)、V(D)J重组和维持端粒结构等方面起关键作用，参与转录及细胞凋亡等过程;同时，还参与肿瘤细胞的放疗和化疗耐受性。Akt在调节细胞生长、增值、凋亡、代谢和细胞迁移等方面发挥重要作用。但是，关于DNA-PKcs/Akt信号通路是否在氢醌诱导的K562细胞损伤和细胞凋亡中发挥作用，目前还没有报道。本研究将探讨DNA-PKcs/Akt及其下游信号通路在氢醌诱导的K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用及其机制。 第一部分:ROS和DNA-PKcs/Akt信号通路在氢醌诱导K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用 目的:探讨ROS和DNA-PKcs/Akt信号通路的活化在氢醌诱导的人慢性白血病细胞(human chronic leukemia cells) K562损伤和细胞凋亡中的作用。 方法:运用CCK-8法检测细胞增殖情况;利用AnnexinV-FITC/Propidium Iodine凋亡检测试剂盒，采用流式细胞仪检测氢醌(hydroquinone，HQ)诱导K562细胞凋亡情况;运用分子探针CM-H2DCFDA和DHE，利用流式细胞仪测定氢醌诱导K562细胞内ROS的产生情况;用免疫荧光法检测DNA-PKcs的蛋白表达;Real-time PCR检测DNA-PKcs和Akt1的mRNA表达;采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法测定DNA-PKcs、Akt和P-Akt(phospho-Akt Ser473)蛋白表达情况。 结果: CCK-8法实验结果表明，氢醌对K562细胞的生长有很强的抑制作用，呈剂量-反应和时间-反应关系。流式细胞仪检测表明，在氢醌诱导的细胞损伤和凋亡中，0-50μM时，随着剂量的加大，ROS的产生和细胞凋亡率也增加，都存在剂量-反应关系;两者之间存在正相关关系;100μM时，ROS的产生下降，细胞凋亡率最高。将50μM氢醌处理K562细胞不同的时间(0、3、6、12和24h)，0-12h时，随着作用时间的延长，DCF的荧光强度逐渐增加，存在时间-反应关系;处理24h时，ROS的产生明显减少。实时定量PCR和Western Blotting检测显示，0-100μM时，DNA-PKcs和Akt1的基因表达均随氢醌剂量的加大而增加，DNA-PKcs和P-Akt的蛋白表达也随氢醌剂量的加大而增加，都存在剂量-反应关系，然而，Akt的蛋白表达没有变化。 结论:本研究结果显示，氢醌诱导ROS的产生和DNA-PKcs/Ak信号通路，与K562细胞损伤和凋亡有相关性。 第二部分:NU7026通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路增强氢醌诱导的K562细胞凋亡 目的:探讨NU7026通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路，对氢醌诱导K562细胞凋亡的作用。 方法:运用细胞直接计数法检测细胞增殖情况;利用AnnexinV-FITC/PropidiumIodine凋亡检测试剂盒，采用流式细胞仪检测氢醌(hydroquinone，HQ)诱导K562细胞凋亡情况;运用分子探针CM-H2DCFDA和DHE，利用流式细胞仪测定氢醌诱导K562细胞内ROS的产生情况;用免疫荧光法检测DNA-PKcs的蛋白表达;Real-timePCR检测DNA-PKcs和Akt的mRNA表达;采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法测定相关蛋白，包括信号通路中相关激酶DNA-PKcs、Akt、P-Akt(phospho-AktSer473)、Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表达情况。 结果:我们采用DNA-PKcs（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）特异的抑制剂NU7026与不同浓度(0、10、25、50和100μM)氢醌(Hydroquinone，HQ)共同处理K562细胞，研究氢醌导致细胞凋亡的作用，以及调控的信号通路。细胞直接计数实验证明，预先用NU7026孵育K562细胞1h，采用不同浓度氢醌（0、10、25、50和100μM）处理K562细胞24h后，NU7026对DNA-PKcs的抑制可显著增强氢醌对K562细胞的毒性作用，抑制细胞的活性，并存在剂量-反应关系。NU7026与不同浓度氢醌（0、25、50和100μM）共同处理K562细胞24h后，诱导细胞凋亡率增加。NU7026与氢醌联合作用，不影响活性氧的产生和氢醌的氧化应激，但导致DNA-PKcs基因水平和蛋白水平的表达下降。此外，氢醌增加Akt的磷酸化，使Akt活化;最后，它与NU7026联合作用阻止了Akt的活化，增加促凋亡蛋白Bax和caspase-3蛋白的表达，但降低抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达。该结果揭示了DNA-PKcs在氢醌血液毒性中的核心作用，它负责参与DNA双链断裂修复、细胞周期的进行和细胞凋亡的调节，以应对氢醌引起的K562细胞DNA损伤和细胞凋亡。 结论:NU7026增强了氢醌诱导人慢性白血病细胞K562的细胞凋亡，通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路，导致其下游蛋白Bcl-2下调，以及Bax和caspase3上调。

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英文缩略词表

摘要

引言

第一部分 ROS和DNA-PKcs／Akt信号通路在氢醌诱导K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第二部分 NU7026通过抑制DNA-PKcs／Akt信号通路增强了氢醌诱导K562细胞凋亡的作用

引言

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

综述 DNA-PK与白血病关系的研究进展

攻读博士期间发表的论文

致谢