磷酸酶DUSP14对TNFα与IL-1β诱导的NF-κB信号通路的调控机制

摘要

核转录因子κB(Nuclear factor-kappaB，NF-κV)是广泛存在于机体内多种细胞中的一种非常关键的核转录因子，NF-κB在机体内许多免疫反应和炎症反应的调节过程中发挥着重要的作用，参与了细胞内多种蛋白分子的表达调控。 在细胞内，蛋白的磷酸化反应是一个可逆的动态的蛋白修饰调节过程。蛋白的磷酸化(phosphorylation)修饰以及去磷酸化(Bephosphorylation)修饰是由特定的蛋白激酶(protein kinase)以及蛋白磷酸酶(protein phosphatase)这两种作用相反的能够调节蛋白磷酸化水平的酶来共同调节的，以保证蛋白的磷酸化水平维持一个动态的平衡状态。 在由TNFα以及IL-1β所介导的NF-κB信号传导通路中，可逆性的磷酸化蛋白修饰发挥着非常关键的修饰调节功能。其中，TAK1、IKK以及p65等信号蛋白的可逆性的磷酸化修饰在NF-κB信号通路中都发挥着非常重要的调节作用。推测，在细胞内应该还存在着某一些新的蛋白激酶或是蛋白磷酸酶参与由TNFα以及IL-1β所介导的NF-κB信号传导通路中。 为了探索能够参与进TNFα和IL-1[所介导的NF-κB信号通路中的未知功能的蛋白，从Origene公司购买了小鼠的单克隆真核表达载体的文库，其中含有3000个小鼠的单克隆真核表达载体。在293细胞中利用NF-κB作为报告基因，用肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1[作为细胞的刺激物，通过双荧光素酶报告基因的实验检测了这3000个小鼠基因所表达产生的蛋白对由TNFα和IL-1β所诱导的NF-κB的激活的影响。 通过报告基因实验，筛选得到了一个能够显著抑制由TNFα和IL-1β所诱导的NF-κB的激活的蛋白，这个蛋白名为DUSP14，是双特异性磷酸酶(DUSPs)家族中的一员。DUSP14蛋白分子是由198个氨基酸残基组成，其中DUSP14的氨基末端上含有一个能够催化底物蛋白发生去磷酸化反应的双特异性磷酸酶的催化结构域DSPs(Dual-specificity phosphatase catalytic domain，DSPs)。DUSP14分子上的催化活性区域内的一段序列H110CAAGVSR117能够介导DUSP14与底物蛋白上的磷酸基团相结合，在催化活性区域中非常关键的催化活性位点是第111位的半胱氨酸(cysteine111)。 双荧光素酶报告基因的实验结果表明，过量表达的DUSP14能够抑制TNFα以及IL-1β诱导的NF-κB的激活，另外通过RNA干扰技术减少内源性DUSP14的表达可以协同增强TNFα以及IL-1β诱导的NF-κB的激活。我们的实验研究表明，DUSP14通过介导TAK1的去磷酸化负反馈调控NF-κB的信号通路。第一，过量表达的DUSP14能够和TAK1发生相互作用。另外在生理条件下，内源性的DUSP14和TAK1具有相互作用，并且这种相互作用是依赖于TNFα以及IL-1β的刺激;第二，过量表达的DUSP14能够非常显著地抑制TNFα以及IL-1β所诱导的TAK1的激活。但是缺失了酶活催化位点的DUSP14的C111S突变体在过量表达时对于由TNFα以及IL-1β所介导的TAK1激活的抑制作用是被明显地降低了;第三，在过表达的情况下，DUSP14能够去磷酸化修饰TAK1，同时DUSP14的C111S突变体不具备去磷酸化TAK1的功能，另外通过RNA干扰技术减少内源性的DUSP14的表达可以增强TNFα以及IL-1β诱导的TAK1的磷酸化。这些实验结果可以表明，DUSP14能够去磷酸化修饰TAK1，并抑制TAK1的激活。 磷酸化与去磷酸化的蛋白修饰在由TNFα以及IL-1β所介导的NF-κB的信号传导通路中具有非常重要的调控功能。我们的实验研究证实了磷酸酶DUSP14在NF-κB信号通路中具有非常重要的调节作用，研究表明DUSP14能够通过去磷酸化TAK1来抑制TAK1的激活，从而抑制NF-κB的激活。我们的研究进一步地表明了磷酸化以及去磷酸化蛋白修饰在NF-κB的信号通路中的重要作用，并为进一步地深入探索蛋白磷酸酶在NF-κB信号通路中的功能提供了新的证据。 文献报道表明，TAK1是TNFα以及IL-1β诱导的NF-κB信号通路中一个非常重要的信号蛋白，但是目前对TAK1功能的精细的调控机制仍然不是非常清楚。在本课题中，我们的研究探索了TAK1翻译后修饰的一种新的机制，为进一步地深入探索TAK1在由TNFα以及IL-1β所介导的NF-κB的信号通路中的功能提供了一些新的证据。

目录

声明

摘要

第一部分研究背景

1．1炎症反应简介

1．2炎症因子简介

2 TNFα以及IL-1β所介导的NF-kB信号通路

2．1 NF-kB的生物学功能

2．2 NF-kB及其相关分子的简介

2．3激活NF-kB的分子机制

2．4激活NF-kB的上游信号转导途径

3蛋白磷酸酶在天然免疫中的调控作用

3．1蛋白的可逆磷酸化修饰的简介

3．2蛋白磷酸酶的概述

3．3蛋白磷酸酶在天然免疫反应中的调控作用

第二部分研究工作

1．1实验材料

1．2实验方法

2 实验结果

2．1本课题的研究背景以及立项依据的概述

2．3 DUSP14对由TNFα和IL-1β所诱导的NF-kB激活的影响

2．4 DUSP14RNAi对NF-kB信号通路的影晌

2．5 DUSP14和TAK1的相互作用

2．6 DUSP14介导TAK1的去磷酸化并抑制TAK1的激活

2．7讨论与展望

参考文献

缩略语标注

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