蝎丝氨酸蛋白酶抑制剂Sj7170促神经胶质瘤生长和转移研究

摘要

神经胶质瘤是成人中最常见的原发性恶性脑瘤。目前被确诊为神经胶质瘤的患者，大约有一半是处于晚期阶段，神经胶质瘤患者平均预期的寿命约为14-18个月左右，因而神经胶质瘤是恶性程度最高的肿瘤之一。现有的科学研究表明神经胶质瘤侵袭行为的分子机制十分复杂且仍不清楚。因此，作为分子工具的神经胶质瘤调节剂(激活剂和抑制剂)的发现将有助于揭示神经胶质瘤发生的分子机制，也有利于研发治疗和诊断神经胶质瘤的药物和技术。 丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPIs)广泛存在于各种生物体及其组织中，如寄生虫、吸血性无脊椎动物、两栖类动物的皮肤和有毒动物的毒腺分泌物，SPIs具有重要的生理/病理功能。近来研究表明Serpin和Kunitz家族的SPIs能导致肿瘤细胞恶性程度的增高。然而，所有报道的SPIs均是由内源性的人类细胞所分泌的，还没有任何关于外源性SPIs促肿瘤作用的报道，并且内源性SPIs促肿瘤的分子机制仍然不清楚，更为重要的是，SPIs促肿瘤研究还从未涉及神经胶质瘤。因此，发现新型SPIs并研究其促神经胶质瘤作用及其机制具有重要的科学意义与应用价值。 本研究从普洱真蝎cDNA文库中筛选鉴定到一条cDNA序列，命名为Sj7170。Sj7170的全长cDNA序列为459个核苷酸，开放阅读框含有261个核苷酸共编码86个氨基酸残基，其中包含24个残基的信号肽和62个残基的成熟肽，形成5对二硫键。序列比对的结果表明Sj7170具有典型的Ascaris型抑制剂的特征，并且可能存在潜在的丝氨酸蛋白酶抑制活性。基于Sj7170的cDNA序列设计了特异性引物，通过PCR扩增成熟肽序列，构建重组表达质粒pET-28a-Sj7170，并将其转化到大肠杆菌中，得到了色谱纯的重组Sj7170多肽。在体内外检测了重组Sj7170多肽的丝氨酸蛋白酶抑制活性。结果表明，rSj7170可以特异性地抑制胰凝乳蛋白酶的活性，并且体外的抑制常数Ki值为3.9×10-7M，对胰蛋白酶和弹性蛋白酶的活性没有明显的影响。 进一步研究发现蝎丝氨酸蛋白酶抑制剂Sj7170能促神经胶质瘤细胞的增殖。细胞计数实验结果表明rSj7170对神经胶质瘤细胞U87和U251的增殖均有显著的促进作用。细胞克隆形成实验显示rSj7170同样能增强单个U87细胞形成克隆菌落的能力。细胞周期流式分析发现，rSj7170使U87细胞从G1期进入S期的时间缩短，从而加速了U87细胞周期的进程。Western blot研究结果表明，rSj7170促进了周期蛋白cyclinD1和周期转录激活子E2F1的表达，增强了Rb2/pl30蛋白的磷酸化，抑制了周期转录抑制子E2F5的表达。通过构建下调周期蛋白cyclinD1细胞系进一步确证了cyclinD1在Sj7170促细胞增值过程中起到的重要作用。动物体内实验进一步证实，rSj7170促进了U87细胞在裸鼠体内肿瘤的形成和生长，同时上调了肿瘤组织中cyclinDl的表达。 研究还发现蝎丝氨酸蛋白酶抑制剂Sj7170能促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。Transwell实验表明，rSj7170能显著的促进神经胶质瘤U87和U251的迁移和侵袭，改变倍数均为10倍以上。EMT标记蛋白实验显示，rSj7170能上调神经胶质瘤细胞U87和U251中Vimentin和Snail蛋白的表达，抑制E-cadherin的表达，诱导神经胶质瘤细胞U87和U251上皮特征向间质特征转化。进一步构建下调转录因子Snail细胞系的结果表明，Snail下调后rSj7170的促迁移和侵袭作用消失。因此Snail蛋白的上调和EMT过程的发生对于Sj7170促神经胶质瘤细胞迁移和侵袭功能获得和发生起着不可或缺的作用。而cyclinD1下调后rSj7170仍然具有促进细胞迁移和侵袭的能力，因此cyclinD1并没有在此过程中发挥作用。免疫荧光实验结果显示，rSj7170通过Rho GTPase通路来使细胞骨架发生重排，从而使神经胶质瘤细胞U87的细胞球状生长形态发生改变，使之贴壁性更强。 最后进一步探索了Sj7170蛋白酶抑制活性和促神经胶质瘤生长和转移作用的关系。根据Sj7170的胰凝乳蛋白酶抑制活性关键位点，在分子水平上设计了10个Sj7170的突变体，采用overlapping PCR的方法获得了Sj7170的10个突变体基因序列，利用与野生型Sj7170相同的表达纯化系统，表达纯化了10个Sj7170突变体多肽，分别测定其蛋白酶抑制活性和促神经胶质瘤细胞增殖和转移能力。胰凝乳蛋白酶抑制活性测定实验发现，突变体Sj7170-G35A的二级结构和蛋白酶抑制活性与野生型Sj7170相比，均发生了显著的改变，其Ki值为2.1×10-9M，抑制活性较Sj7170提高了185.71倍。但神经胶质瘤细胞增殖实验结果显示与野生型Sj7170相比，突变体Sj7170-G35A并没有极大地促进神经胶质瘤细胞U87的生长和增殖。同时，其它9个突变体多肽的胰凝乳蛋白酶抑制活性较野生型Sj7170变化不大，并且也不具有促神经胶质瘤细胞增殖的能力。细胞迁移实验结果显示，Sj7170的10个突变体促进神经胶质瘤U87细胞迁移的能力与蛋白酶抑制活性之间并没有很好的相关性。这些结果均表明，Sj7170的这两种功能之间并没有直接的联系，其促神经胶质瘤细胞增殖和迁移功能并不依赖于其蛋白酶抑制活性功能，二者可能在生物体内发挥不同的生物学效应。 综上所述，本研究发现的Sj7170是首个分离鉴定的具有丝氨酸蛋白酶抑制活性和神经胶质瘤激活效应的双功能分子，不仅对深入了解蝎毒素的天然多肽库提供了新的视角，同时也为丝氨酸蛋白酶抑制剂作为肿瘤生长/转移调节剂提供了新的发现，加强了丝氨酸蛋白酶抑制和肿瘤生长转移激活剂之间的功能联系，这些都有助于进一步揭示肿瘤发生的分子机制，并提示其可能具有潜在价值。

目录

声明

摘要

中英文缩略对照表

1．1．1引言

1．1．3蝎毒素的种类和应用价值

1．1．4小结

1．2丝氨酸蛋白酶抑制剂

1．2．1引言

1．2．2丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能和分类

1．2．3毒液动物丝氨酸蛋白酶抑制剂

1．2．4丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用前景

1．2．5丝氨酸蛋白酶抑制剂在神经胶质瘤中的研究进展

1．2．6小结

1．3神经胶质瘤

1．3．1引言

1．3．2神经胶质瘤的流行病学

1．3．3神经胶质瘤的治疗

1．3．4小结

1．4蝎毒素在神经胶质瘤治疗中的研究进展

1．4．1引言

1．4．2蝎毒素在肿瘤治疗中的研究进展

1．4．3蝎毒素在神经胶质瘤治疗中的研究进展

1．4．4小结

1．5本研究工作的出发点

第二章Sj7170基因的分离、表达与纯化

2．1引言

2．2实验材料和仪器

2．2．1质粒和菌株

2．2．3试剂

2．2．4溶液配制

2．2．5仪器和设备

2．2．6生物学数据库和软件

2．3实验方法

2．3．1引物设计

2．3．2重组表达载体pET-28a-Sj7170的构建

2．3．3 Sj7170多肽的诱导表达和纯化

2．4实验结果

2．4．1 Sj7170的序列分析

2．4．2重组表达载体pET-28a-Sj7170的构建

2．4．3重组Sj7170多肽的表达纯化与鉴定

2．5讨论

第三章Sj7170多肽对体内外蛋白酶抑制活性研究

3．1引言

3．2实验材料和仪器

3．2．1细胞系

3．2．2试剂及配制

3．2．3仪器和设备

3．3实验方法

3．3．1细胞培养

3．3．2体外丝氨酸蛋白酶抑制活性测定方法

3．3．3体内丝氨酸蛋白酶抑制活性测定方法

3．4实验结果

3．4．1体外重组Sj7170蛋白抑制活性鉴定

3．4．2体内重组Sj7170蛋白抑制活性鉴定

3．5讨论

第四章Sj7170多肽促神经胶质瘤U87和U251细胞体外增殖作用研究

4．1引言

4．2实验材料和仪器

4．2．1细胞系

4．2．2试剂及其配制

4．2．3抗体

4．2．4试剂盒

4．2．5仪器和设备

4．2．6生物学软件

4．3实验方法

4．3．1细胞培养

4．3．2细胞增殖计数法

4．3．3细胞周期分析

4．3．4软琼脂克隆形成

4．3．5 Western Blot检测

4．3．6细胞总RNA的提取和检测

4．3．7 RNA样品的cDNA合成

4．3．8实时定量PCR

4．3．9 CyclinD1下调稳转U87细胞的建立

4．3．1 0 Cofocol检测多肽Sj7170的定位

4．4实验结果

4．4．1 Sj7170促进U87和U251细胞增殖

4．4．2 Sj7170促进U87细胞克隆形成

4．4．3 Sj7170对U87细胞周期的影响

4．4．4 CyclinD1下调稳转细胞系的构建

4．4．5 Sj7170对CyclinD1下调细胞系增殖的影响

4．4．6 Sj7170在U87细胞中的亚细胞定位

4．5讨论

第五章Sj7170多肽促神经胶质瘤U87细胞体内增殖作用研究

5．1引言

5．2实验材料和仪器

5．2．1细胞系和实验动物

5．2．2试剂和材料

5．3实验方法

5．3．1裸鼠皮下成瘤动物模型的建立

5．3．2裸鼠肿瘤组织和的获取

5．3．3组织切片

5．4．2免疫组化检测肿瘤组织中CyclinD1的表达

5．4．3体外检测肿瘤组织中CyclinD1基因的表达水平

5．5讨论

第六章Sj7170多肽促神经胶质瘤U87和U251细胞迁移和侵袭效应研究

6．1引言

6．2实验材料和仪器

6．2．1细胞系

6．2．2试剂及其配制

6．2．3试剂盒及仪器

6．3实验方法

6．3．1细胞培养

6．3．2细胞划痕实验

6．3．3细胞体外迁移实验

6．3．4细胞体外侵袭实验

6．3．5 Western blot检测

6．3．6实时定量PCR

6．3．7 MMP2和MMP9蛋白的ELISA检测

6．3．8免疫荧光分析

6．3．9 Snail下调稳转U87和U251细胞的建立

6．4实验结果

6．4．1 Sj7170促进U87和U251细胞的迁移和侵袭

6．4．2 Sj7170诱导细胞EMT过程的发生

6．4．3 Sj7170对cyclinD1下调细胞系迁移和侵袭的影响

6．4．4 Sj7170促使U87细胞形态发生变化

6．4．5 Sj7170促使U87细胞骨架发生重排

6．5讨论

第七章Sj7170多肽的蛋白酶抑制活性与促神经胶质瘤生长和转移作用的关系研究

7．1引言

7．2实验材料和仪器

7．2．1细胞系

7．2．2试剂及其配制

7．2．3试剂盒及仪器

7．3实验方法

7．3．1 Sj7170定点突变与鉴定

7．3．2 Sj7170突变体的体外丝氨酸蛋白酶抑制活性测定

7．3．3 Sj7170突变体对细胞形态和增殖的影响

7．3．4 Sj7170突变体对细胞迁移的影响

7．4实验结果

7．4．1 Chymostatin对U87细胞形态和增殖的影响

7．4．2 Sj7170突变体二级结构的测定

7．4．3 Sj7170突变体体外酶抑制活性的测定

7．4．4 Sj7170突变体对U87细胞增殖的影响

7．4．5 Sj7170突变体对U87细胞迁移的影响

7．5讨论

研究总结与展望

参考文献

博士研究生期间发表及待发表的论文

致谢