一种蝎抗神经胶质瘤肽及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种蝎抗神经胶质瘤肽及其制备方法和应用，蝎抗神经胶质瘤肽重组大肠杆菌Escherichia coli DE3/rBmKCT/pGEX－5X，CCTCC NO：M206015，其特征是：首先是设计引物，以从蝎毒腺cDNA文库中筛选蝎抗神经胶质瘤肽基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得含有限制性内切酶的切位点序列的蝎抗神经胶质瘤肽的基因或基因片段；其次是用限制性内切酶对PCR产物和表达载体质粒进行酶切；第三是用T4DNA连接酶，构建重组表达载体rBmKCT/pGEX；第四是将重组表达载体rBmKCT/pGEX转化感受态大肠杆菌DE3，构建成基因工程菌(大肠杆菌DE3/rBmKCT/pGEX－5X)。本发明方法简便，安全性高，生产成本低廉，纯化简单且产物纯度高，蝎抗神经胶质瘤肽在制备治疗或预防神经胶质瘤的药物中的应用。

说明书

                           技术领域

本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种蝎抗神经胶质瘤肽以及产生蝎抗神经胶质瘤肽的方法，具体地说，本发明涉及蝎抗神经胶质瘤肽重组大肠杆菌及其构建方法，还涉及一种高效生物活性的蝎抗神经胶质瘤肽的制备方法，采用基因工程手段产生蝎抗神经胶质瘤肽的方法，产生的蝎抗神经胶质瘤肽在制备治疗或预防抗神经胶质瘤的药物中的应用。

                           背景技术

蝎毒有复杂的成分和性质而产生多种生理、药理活性，对抗肿瘤、治疗风湿、抗癫痫以及心血管疾病有重要治疗作用，但是由于蝎毒成分复杂，结构相似，难以分离，许多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低，这些无疑都限制了蝎毒的研究和应用。通过基因工程的方法生产有效的蝎毒成分则变得十分必要。在世界范围内，已经获得蝎毒基因几百条，然而能够成功进行表达产生有效蝎毒成分的基因却仅有几十条，其难点主要是产量太低，无法进行后序工作、形成不可溶的包含体、不能正确折叠成为有活性的蛋白质、对表达宿主有毒或者与宿主不匹配而完全不能表达。用于蝎毒基因成功表达的宿主系统多种多样，如大肠杆菌、杆状病毒、酵母、真核细胞以及烟草、杨树等。这些表达系统各有优劣，而且视不同基因而异。最近，张守涛等(张守涛，郭霭光，肖乐义，董建军，赵天增，薛歧庚，孔天翰，郭唯《西北农林科技大学学报》2002年30卷6期：30-33)通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增得到东亚钳蝎神经毒素BmKCT的cDNA并克隆到pTrcHisA表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达生产蝎BmKCT肽，然而其产量不高，且大部分形成包含体，不可溶。而且设计的PCR引物中不含有将表达载体中的多个组氨酸与BmKCT肽分割开的蛋白酶酶切位点，使得表达产生的BmKCT肽必然是一个含有多个额外组氨酸(His)和其它氨基酸序列的融合重组蛋白。这些额外的组氨酸和其它氨基酸序列会影响重组肽的结构以至它相关的功能。

中国学者李文鑫、曾宪春、朱顺义等构建了高质量的东亚钳蝎(Buthusmartensii Karsch)毒腺细胞cDNA文库，从库中筛选出一种氯离子通道调节剂的基因(GenBank登录号为AF 135821)(Xian-Chun Zeng，Wen-Xin Li，Shun-YiZhu，Fang Peng，Zhi-Hui Zhu，Kai-Lang Wu，Fu-Hua Yiang.Cloning andcharacterization of a cDNA sequence encoding the precursor of aChlorotoxin-like peptide from the Chinese scorpion Buthus martensiiKarsch.Toxicon 38：1009～1014，2000)，其编码的氨基酸序列与从非洲蝎分离的氯毒素(chlorotoxin)具有68％的同源性，命名为东亚钳蝎氯毒素(Buthusmartensii Karsch ChloroToxin，BmKCT)基因。我们构建了该基因的基因工程菌并进行高效表达和纯化，研究表明，重组BmKCT蛋白可以有效抑制星型胶质瘤细胞U251细胞膜上的氯电流(杨锐，彭方，刘辉，曹志贱，李文鑫，毛歆，蒋达和，东亚钳蝎氯毒素bmkct的表达和功能鉴定，《中国生物化学与分子生物学报》2005年21卷1期：19～23)，而且有明显的抗神经胶质瘤的活性，因此我们称此cDNA序列为蝎抗神经胶质瘤肽基因，在该cDNA指导下合成的多肽为蝎抗神经胶质瘤肽。

                           发明内容

本发明的目的是在于提供一种蝎抗神经胶质瘤肽重组大肠杆菌，能表达具有活性的抗神经胶质瘤肽，可溶，产量高。

本发明的另一个目的还在于提供一种蝎抗神经胶质瘤肽重组大肠杆菌的构建方法，方法简便，安全性高，生产成本低廉，纯化简单且产物纯度高。

本发明的再一个目的是提供一种用基因工程方法产生的蝎抗神经胶质瘤肽在制备治疗或预防抗神经胶质瘤的药物中的应用。

为了实现上述目的，构建了一种能表达蝎抗神经胶质瘤肽的重组大肠杆菌(Escherichia coli)DE3(含重组质粒rBmKCT/pGEX-5X)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期2006年1月20日，保藏编号：CCTCC NO：M206015，分类命名：Escherichia coli(DE3)/rBmKCT/pGEX-5X，该菌属于革兰氏阴性菌，能在LB(Luria-Bertani)培养基(胰化蛋白胨10克/L，酵母提取物5克/L，氯化钠10克/L，pH7.0)中快速生长，重组大肠杆菌它含有重组质粒rBmKCT/pGEX-5X，此质粒以tac为启动子，具有氨苄青霉素抗性，携带谷胱甘肽转移酶基因，并在此基因下游连接了蝎抗神经胶质瘤肽基因，连接处含有小肠激酶酶切位点的基因序列。可以用于生产具有抗神经胶质瘤活性的蝎抗神经胶质瘤肽。

本发明构建生产蝎抗神经胶质瘤肽的方法，包括设计PCR上游和下游引物，用PCR技术从东亚钳蝎蝎毒cDNA库中扩增抗神经胶质瘤肽基因片段，并通过表达载体转化到受体菌大肠杆菌DE3(Fan Peng，Xianchun Zeng，Xiaohua He，Jun Pu，Wenxin Li et al，Molecular cloning and functional expression of a gene encoding anantiarrhythamia peptide derived from the scorpion toxin，Eur.J.Biochem.，269：4468-4475，2002)。其特征是，设计的PCR引物含小肠激酶酶切位点，将PCR扩增的抗神经胶质瘤肽基因片段经过限制性内切酶酶切，克隆到表达载体pGEX-5x-1质粒(FanPeng，Xianchun Zeng，Xiaohua He，Jun Pu，Wenxin Li et al，Molecular cloning and functionalexpression of a gene encoding an antiarrhythamia peptide derived from the scorpion toxin，Eur.J.Biochem.，269：4468-4475，2002)中，转化到大肠杆菌DE3中获得重组大肠杆菌DE3(含rBmKCT/pGEX重组质粒)，用于生产可溶的且有活性的重组蝎抗神经胶质瘤肽。采用本发明的方法生产的蝎抗神经胶质瘤肽具有抑制神经胶质瘤特异性氯离子通道的作用。其构建步骤如下：

a)从自建的蝎毒腺cDNA文库(Xian-Chun Zeng，Wen-Xin Li，Shun-Yi Zhu，Fang Peng，Zhi-Hui Zhu，Kai-Lang Wu，Fu-Hua Yiang.Cloning andcharacterization of a cDNA sequence encoding the precursor of aChlorotoxin-like peptide from the Chinese scorpion Buthus martensiiKarsch.Toxicon 38：1009～1014，2000)中筛选氯离子通道抑制剂BmKCT基因的cDNA序列，除了编码信号肽序列以外，在其推导的35个氨基酸的成熟肽序列中，与从非洲蝎分离的chlorotoxin(氯毒素)具有68％的同源性，称此cDNA序列为蝎抗神经胶质瘤肽基因：基因序列为SEQID NO：1。

gcaaaactct attaaaaatg aagttcctct acggaatcgt tttcattgca ctttttctaa     60

ctgtaatgtt cgcaactcaa actgatggat gtgggccttg ctttacaacg gatgctaata    120

tggcaaggaa atgtagggaa tgttgcggag gtattggaaa atgctttggc ccacaatgtc    180

tgtgtaaccg tatatgaata attaaaaatg tacacctgaa cagatcattt aatgaataat    240

aaatattaat aagcattaaa a                                              261

上述为蝎抗神经胶质瘤肽的cDNA序列，18-197核苷酸序列为蛋白质编码区，其中18-89核苷酸序列编码信号肽区，其余的编码区部分是成熟肽，238-243序列为多聚腺嘌呤核苷酸加尾信号序列。所以该基因可以编码下列蛋白质前体的合成：

MKFLYGIVFI ALFLTVMFAT QTDGCGPCFT TDANMARKCR ECCGGIGKCF GPQCLCNRI      59

该蛋白质前体经过翻译后的加工就可以形成有活性的成熟蛋白质-蝎抗神经胶质瘤肽：

CGPCFTTDAN MARKCRECCG GIGKCFGPQC LCNRI                                35

b)根据蝎抗神经胶质瘤肽基因序列(SEQID NO：1)设计引物A1(5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGTGTGGGCCTTGCTTTAC-3’)和A2(5’-GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTG-3’)，进行PCR扩增，就可以获得含有限制性内切酶酶切位点序列的蝎抗神经胶质瘤肽的基因或基因片段：

gccggatccc cgatgacgat gacaagtgtg ggccttgctt tacaacggat gctaatatgg     60

caaggaaatg tagggaatgt tgcggaggta ttggaaaatg ctttggccca caatgtctgt    120

gtaaccgtat atgactgctc ccg                                            143

c)用限制性内切酶对回收的PCR产物和表达载体pGEX-5x-1质粒分别进行酶切。

d)用T₄ DNA连接酶，连接酶切后的蝎抗神经胶质瘤肽基因和表达载体pGEX-5x-1，构建重组表达载体rBmKCT/pGEX。

e)制备感受态大肠杆菌DE3，将连接产物(rBmKCT/pGEX)转化入大肠杆菌DE3中，将得到的克隆子通过酶切或PCR鉴定后对扦入片段进行测序，测序结果正确的克隆子即为含有蝎抗神经胶质瘤肽基因的重组大肠杆菌DE3(含重组质粒rBmKCT/pGEX-5X)。

一种优化的构建蝎抗神经胶质瘤肽重组大肠杆菌的方法：其特征是：

PCR上游引物(SEQ ID NO：2)

A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGTGTGGGCCTTGCTTTAC-3’，该引物含有BamHI限制性内切酶酶切位点和小肠激酶酶切位点；

PCR下游引物(SEQ ID NO：3)

A2，5’-GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTG-3’该引物含有XhoI限制性内切酶酶切位点。

用PCR扩增所得产物经BamHI和XhoI酶切后克隆到pGEX-5x-1，转化入大肠杆菌DE3中构建重组大肠杆菌DE3(含rBmKCT/pGEX-5X)。

根据蝎抗神经胶质瘤肽基因编码的成熟肽段，即除了信号肽序列以外的基因片段进行设计引物，即蝎抗神经胶质瘤肽cDNA 87-101nt处设计PCR上游引物A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGTGTGGGCCTTGCTTTAC-3’含有BamHI限制性内切酶酶切位点和小肠激酶酶切位点序列；根据蝎抗神经胶质瘤肽的cDNA174-197nt处设计下游引物A2，5’-GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTG-3’含有XhoI限制性内切酶酶切位点。用PCR扩增所得产物经BamHI和XhoI酶切后克隆到pGEX-5x-1中再转化入大肠杆菌DE3得到蝎抗神经胶质瘤肽重组大肠杆菌DE3(含重组质粒rBmKCT/pGEX-5X)，用以表达具有生物活性的蝎抗神经胶质瘤肽。

用此蝎抗神经胶质瘤肽重组大肠杆菌生产得到的肽具有明显抗神经胶质瘤活性，呈可溶，非包涵体状态而且产量高，产量为2mg蝎抗神经胶质瘤肽/L培养物。

一种蝎抗神经胶质瘤肽，其特征是，该活性肽的氨基酸序列如下(SEQ IDNO：4)：

CGPCFTTDANMARKCRECCGGIGKCFGPQCLCNRI。

本发明提供的重组蝎抗神经胶质瘤肽与从蝎抗神经胶质瘤肽cDNA推导的成熟氨基酸序列一致，并且不含有影响生物活性的额外组氨酸片段和其它氨基酸序列。重组蝎抗神经胶质瘤肽呈可溶状态，不形成包含体，即这种肽能真实反应蝎抗神经胶质瘤基因的功能。本发明提供的重组肽不仅具有抑制神经胶质瘤特异性氯离子通道的作用，而且有明显的抗神经胶质瘤作用。

一种生产蝎抗神经胶质瘤肽的方法，包括设计PCR引物，用PCR从东亚钳蝎蝎毒cDNA库中扩增蝎抗神经胶质瘤肽基因片段，并通过表达载体转化到大肠杆菌DE3中表达。其特征是：设计的PCR引物含小肠激酶酶切位点，用PCR扩增的蝎抗神经胶质瘤肽基因片段经过限制性内切酶酶切，克隆到pGEX-5x-1表达载体中，转化到大肠杆菌DE3中获得重组大肠杆菌(Escherichia coli)DE3/rBmKCT/pGEX-5X，经IPTG诱导后，用小肠激酶酶切，获得可溶的蝎抗神经胶质瘤肽：

CGPCFTTDANMARKCRECCGGIGKCFGPQCLCNRI

根据蝎抗神经胶质瘤肽基因序列设计探针对蝎的cDNA库进行筛选获得蝎抗神经胶质瘤肽的基因或基因片段，进行PCR扩增；用限制性内切酶对回收的PCR产物和表达载体pGEX-5x-1质粒进行酶切并用T₄ DNA连接酶连接，构建重组表达载体。转化大肠杆菌DE3获得重组大肠杆菌DE3/rBmKCT/pGEX-5X，经IPTG诱导，表达谷胱甘肽转移酶-蝎抗神经胶质瘤肽融合蛋白，经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后用小肠激酶酶切，得到可溶的且有活性的重组蝎抗神经胶质瘤肽。

一种优化的生产蝎抗神经胶质瘤肽的方法：其特征是：

PCR上游引物A1：

5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGTGTGGGCCTTGCTTTAC-3’，该引物含有BamHI限制性内切酶酶切位点和小肠激酶酶切位点；

PCR下游引物A2：

5’-GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTG-3’，该引物含有XohI限制性内切酶酶切位点。

用PCR扩增所得产物经BamHI和XohI酶切后克隆到pGEX-5x-1，经转化、IPTG诱导表达后用小肠激酶对融合蛋白进行酶切获得可溶性的蝎抗神经胶质瘤肽。

根据蝎抗神经胶质瘤肽基因的成熟肽段的基因片段设计引物，即蝎抗神经胶质瘤肽cDNA 90-106nt处设计PCR上游引物A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGTGTGGGCCTTGCTTTAC-3’含有BamHI限制性内切酶酶切位点和小肠激酶酶切位点；根据蝎抗神经胶质瘤肽cDNA 174-197nt处设计下游引物A2，5’-GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTG-3’含有XohI限制性内切酶酶切位点。用PCR扩增所得产物经BamHI和XohI酶切后克隆到pGEX-5x-1中转化入大肠杆菌DE3，经IPTG诱导表达重组融合蛋白：谷胱甘肽转移酶-蝎抗神经胶质瘤肽，利用谷胱甘肽转移酶亲和层析柱进行纯化，再经小肠激酶酶切，得到具有生物活性的蝎抗神经胶质瘤肽。

根据生产蝎抗神经胶质瘤肽的方法得到重组大肠杆菌DE3/rBmKCT/pGEX-5X于2006年1月20日送中国典型培养物中心保藏，保藏号为CCTCCM206015。

由于不同生产方法所得到的不同重组肽在功能上也必然有所差异。根据本发明的生产方法，所得到的重组肽有以下特点：

1、重组肽中不含有多个His组成的额外片段，与由cDNA推测的成熟肽一致。

2、所得到的重组肽是可溶的非包涵体状态，而且产量高，产量为2mg蝎抗神经胶质瘤肽/L培养物。

3、通过大白鼠脑神经胶质瘤模型证明所得到的重组肽是一种有效的神经胶质瘤抗性多肽，对大白鼠脑神经胶质瘤的抑制率为61％。

蝎抗神经胶质瘤肽在制备治疗或预防抗神经胶质瘤的药物中的应用。

利用基因工程方法生产的蝎抗神经胶质瘤肽在制备治疗或预防抗神经胶质瘤的药物中的应用。

本发明提供的蝎抗神经胶质瘤肽以及通过本发明的方法生产的蝎抗神经胶质瘤肽可以用于制备抗神经胶质瘤药物。这种蝎抗神经胶质瘤肽可与药学上可接受的载体，例如；赋形剂如葡萄糖、乳糖、甘露醇、甘氨酸、水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等；吸收促进剂如脱氧胆酸钠、牛磺甘胆酸盐、N-甲基吡咯烷酮、EDTA、Tween-80、SDS等；增粘剂如甲基纤维素、聚丙烯酰胺、玻璃酸钠等或与其它治疗抗神经胶质瘤药物混合使用。本发明生产的蝎抗神经胶质瘤肽可以组合物的形式通过注射、眼结膜吸收、鼻吸入、皮肤吸收、直肠内给药的方式以水剂、固定剂或其它剂型使用。本发明生产的蝎抗神经胶质瘤肽可以与一种或多种载体混合，然后按照药学领域的常规生产方法将其制成所需的剂型。这种药物组合物含有重量比可以为0.2％-90％的蝎抗神经胶质瘤肽。

                            附图说明

图1表达载体pGEX-5x-1示意图。

tac启动子，可以用IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导来表达目的蛋白质；氨苄青霉素抗性，作为阳性克隆子的筛选标记；含有谷胱甘肽转移酶基因，与目的基因融合表达，其产物可用谷胱甘肽配体亲和层析进行分离纯化。

图2重组表达载体pGEX-5x-1-蝎抗神经胶质瘤肽(rBmKCT/pGEX)的构建示意图。

GST表示谷胱甘肽转移酶；A1是上游引物，含有小肠激酶酶切位点和限制性内切酶BamHI酶切位点；A2是下游引物，含有限制性内切酶XhoI酶切位点；BmKCT为蝎抗神经胶质瘤肽的cDNA序列。

图3蝎抗神经胶质瘤肽重组大肠杆菌中重组表达载体质粒酶切和PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳。

A、酶切鉴定：M1为λDNA/Hind III Markers(23130，9416，6557，4361，2322，2037，564，125bp)，1号为经BamHI酶切的质粒pGEX-5X-1；2号为经BamHI酶切的重组质粒rBmKCT/pGEX；3号为经BamHI和XhoI双酶切的重组质粒rBmKCT/pGEX；4号为PCR鉴定所得的蝎抗神经胶质瘤肽基因片段；M2为DNAMarkers(2000，1000，750，500，250，100bp)。

B、PCR鉴定：M为λDNA/Hind III Markers(23130，9416，6557，4361，2322，2037，564，125bp)；1号为BmKCT阳性对照片段；2号为阴性对照；3-6号为不同的单个克隆子(rBmKCT/pGEX-5X)。

图4SDS-PAGE蛋白质电泳图。

1为蛋白质标记，分别是97，66，45，30，20.1，14.4kDa；2为没有诱导的重组大肠杆菌的总蛋白；3为IPTG诱导了的重组大肠杆菌的总蛋白；4为通过谷胱甘肽转移酶亲和层析柱纯化得到的融合蛋白谷胱甘肽转移酶-蝎抗神经胶质瘤肽，5为小肠激酶酶切后的融合蛋白，6为纯化的蝎抗神经胶质瘤肽。

图5全细胞电压膜片钳记录的氯通道电流图。

A为对照，B为加入重组蝎抗神经胶质瘤肽后的神经胶质瘤细胞氯通道电流。C为经过细胞外液的冲洗后，GCC电流。由图所示，加入600nM后U251表达的GCC电流都明显减小，但氯电流峰值所对应的电压和激活电压不变(B)。而后经过细胞外液的冲洗后，GCC电流有所回复(C)。由此可见，重组BmKCT能明显抑制星型胶质瘤细胞(U251细胞系)由-105-+170mV电压刺激所产生的所有氯离子电流，并且这种抑制作用是可逆的。

图6重组BmKCT融合蛋白对大鼠C6细胞皮下移植瘤的抑瘤作用

rBmKCT组为经抗神经胶质瘤肽处理大鼠的皮下肿瘤组织

对照组为经无菌生理盐水处理大鼠的皮下肿瘤组织

图7¹³¹I-rBmKCT在肿瘤组织的分布

-◆-为注射¹³¹I-rBmKCT测定的结果

-■-为注射Na¹³¹I对照测定的结果

图8大鼠脑内肿瘤核磁共振影像(MRI)扫描图

A对照组经无菌生理盐水处理之前的MRI扫描图

B对照组经无菌生理盐水处理14天的MRI扫描图

C治疗组经抗神经胶质瘤肽处理之前的MRI扫描图

D治疗组经抗神经胶质瘤肽处理14天的MRI扫描图

                       具体实施方式

实施例1：设计引物及PCR扩增蝎抗神经胶质瘤肽基因

按照SEQID NO：1所提供的蝎抗神经胶质瘤肽基因(BmKCT基因)序列设计PCR引物，例如：A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGTGTGGGCCTTGCTTTAC-3’，A2：5’-GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTG-3’，以从蝎毒腺细胞cDNA库中筛选所获得的BmKCT基因(SEQID NO：1)克隆子为模板，进行PCR反应，大量扩增蝎抗神经胶质瘤肽基因。PCR反应条件：1μl Taq聚合酶(1U)、0.5μl四种(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)脱氧单核苷酸等比混合液(10mmol/L)、16.5μl无菌双蒸水、2.5μl 10倍PCR缓冲液、1.5μl氯化镁(25mmol/L)、A1(10μmol/L)和A2(10μmol/L)引物以及BmKCT基因模板各1μl，总体积为25μl。PCR反应过程：94℃预变性300秒、94℃变性60秒、55℃复性60秒、72℃延伸60秒、循环35次、72℃最后延伸300秒。

实施例2：构建重组表达载体(rBmKCT/pGEX)

用限制性内切酶将实施例1中所得PCR产物经过酚∶氯仿∶异戊二醇(25∶24∶1)抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用50μl TE缓冲液(记载本实施例后)溶解沉淀。用限制性内切酶BamHI和XhoI(Takara公司产品)对回收的PCR产物和表达载体pGEX-5x-1质粒进行酶切。酶切反应：BamHI(14U/μl)和XhoI(20U/μl)各1μl，10倍缓冲液2.5μl，PCR产物或pGEX-5x-1质粒50-100ng，加无菌水至总体积为25μl，37℃水浴5小时，酶切产物经酚一氯仿抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用T₄DNA连接酶将PCR产物与表达载体pGEX-5x-1连接，形成重组表达载体(rBmKCT/pGEX)，构建过程见附图2。连接反应：T₄DNA连接酶(1U/μl)1μl，PCR产物与表达载体pGEX-5x-1的摩尔比为3∶1，并且DNA总量为0.1μg，5倍连接酶反应缓冲液4μl，加无菌水至总体积为20μl，16℃放置24小时。

TE(Tris-EDTA)缓冲液：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0

实施例3：获得重组大肠杆菌DE3(rBmKCT/pGEX)

将实施例2中的连接产物转化入大肠杆菌DE3中。在3ml LB液体培养基(胰化蛋白胨10克/L，酵母提取物5克/L，氯化钠10克/L)中接种大肠杆菌DE3，37℃摇床培养至OD₆₀₀达0.4时12000转离心5分钟，去上清，加冰预冷的0.1MCaCl₂120μl重悬菌体。加入连接产物4μl(＜20ng)，冰浴10℃30分钟，放入42℃热激90秒并迅速转入冰浴10℃1-2分钟。加入1mlSOC(胰化蛋白胨10克/L，酵母提取物5克/L，氯化钠10克/L，氯化钾2.5mmol/L，氯化镁10mmol/L，葡萄糖20mmol/L)溶液，37℃摇床培养1小时，1200转离心5分钟，去上清，加100μlSOC溶液重悬菌体并涂布于含氨苄青霉素的LB平板上。从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌落，在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养5小时，然后用PCR扩增的方法对这些培养物进行检测。取所得培养物100μl在100℃水浴中煮60秒以作为PCR检测的模板，PCR的引物、反应条件和反应过程同实施例1。通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳找到经过PCR扩增后有约150bp大小扩增片段的相应培养物，见附图3.对此培养物所含质粒中的扦入片段进行DNA测序(测序引物是针对pGEX-5x-1质粒的通用测序引物)。DNA测序结果与设计的基因序列相符，确定此培养物为所需要的蝎抗神经胶质瘤肽的重组大肠杆菌。已送交中国典型培养物保藏中心保藏，重组大肠杆菌Escherichia coli DE3(rBmKCT/pGEX-5X)CCTCC NO：M206015。

实施例4：重组大肠杆菌DE3/rBmKCT/pGEX-5X(CCTCC NO：M206015)的特征检测

将构建的重组大肠杆菌DE3/rBmKCT/pGEX-5X(CCTCC NO：M206015)经中国典型培养物保藏中心检测，结果表明该菌是一种的革兰氏染色阴性杆菌，各具体特征结果如下表：

表1：rBmKCT基因工程菌各种特性检测结果

  检测项目  结果  检测项目  结果  革兰氏染色  菌落表面颜色  基质色素  细胞形状  细胞大小(μm)  形成内生孢子  运动  鞭毛  接触酶  氧化酶  苯丙氨酸脱氨酶  O-F试验  硝酸盐还原  产H₂S  吲哚  葡萄糖产酸  葡萄糖产气  明胶液化  V-P试验  甲基红  蔗糖还原  柠檬酸  脲酶  α-D-葡萄糖  D-甘露糖  α-环状糊精  D-山梨醇  木糖醇  溴琥珀酸(溴丁二酸)  2氨基乙醇  羟基-L-脯氨酸  -  乳白色  -  杆状   -  +  周生  +  -  +  F  +  -  -  +  +  -  -  +  +/-  -  -  +  +  -  +  -  -  +  -  蜜二糖  松二糖  吐温80  阿东糖醇(侧金盏糖醇)  L-阿拉伯糖  D-阿拉伯醇  D-纤维二糖  i-赤藓糖醇  D-半乳糖  龙胆二糖  D-果糖  L-墨角藻糖  α-D-乳糖  m-肌醇  麦芽糖  海藻糖  D-甘露醇  L-鼠李糖  β-甲基-D-葡萄糖苷  D-棉籽糖  乙酸  丙二酸  L-谷氨酸  β-半乳糖苷酶  水杨苷  七叶苷  甘油  乳糖  D-木糖  D-甘露醇  赖氨酸  +  -  +  -  +  -  -  -  +  -  +  -  +  -  +  +/-  +  +  -  -  +  -  +  +  +/-  -  +  +  +  +  +  定名：Esdherichia coli大肠埃希氏菌(俗称大肠杆菌)

实施例5：重组蝎抗神经胶质瘤肽的表达、酶切和纯化

在含氨苄青霉素的LB液体培养基中以1∶100的比例接种克隆子(重组大肠杆菌DE3/rBmKCT/pGEX)，37℃培养至OD₆₀₀0.8时加入IPTG(终浓度为1.0mM)对培养物进行诱导，并且加入NaOH调培养基的pH值至8.5，然后将培养物在28℃培养4小时以进行目的基因的表达。浓缩诱导后的培养物50倍，超声波破细胞(80HZ，30秒/次，至培养物变清亮为止)，12000rpm离心5分钟，所得上清加入到GST亲和层析胶中充分混合后26℃作用1小时使融合蛋白(GST-蝎抗神经胶质瘤肽)与GST亲和层析胶充分结合。用含50mM的EDTA的Tris-Cl缓冲溶液(1.0mM，pH8.0)反复冲洗GST亲和层析胶去除杂蛋白，然后加入小肠激酶溶液(24ug/mlGST亲和层析胶)，混匀后作用10分钟，对融合蛋白(GST-蝎抗神经胶质瘤肽)进行切割以分开GST和重组蝎抗神经胶质瘤肽。在GST亲和层析胶中加入与GST亲和层析胶等体积的重蒸馏水，收集从GST亲和层析胶中流出的液体并通过15％SDS-PAGE蛋白质电泳检测重组蝎抗神经胶质瘤肽的得率。将收集的含重组蝎抗神经胶质瘤肽溶液经Sephadex G-50脱盐并除去少量可能混入的GST。凝胶过滤的作用过程和条件：100ml Sephadex G-50，用重蒸馏水洗脱，流速为0.4ml/分钟。通过15％SDS-PAGE蛋白质电泳检测收集液中重组蝎抗神经胶质瘤肽的含量并将其冷冻干燥加以保存。(电泳检测结果见图4)

实施例6：重组蝎抗神经胶质瘤肽的氨基酸分析

两种方法水解重组蝎抗神经胶质瘤肽：①6N HCl，110℃真空中处理24小时。②4N甲磺酸、0.2％3-(2-氨基乙酸)吲哚，110℃，在真空中进行24，48，72小时。将样品溶于1.5ml含有40％n-丙醇和0.1％三氟乙酸的溶液中，每管分装0.1ml，用干燥氮气吹干，加入水解试剂后，容器在真空中密封处理，收集水解内容物，除去HCl。用121-MB Beckman氨基酸分析仪根据分析氨基酸的方法分析肽的组分，其结果如下：

 氨基酸  所占摩尔％ 天门冬氨酸(Asp+Asn) 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酸(Glu+Gln) 脯氨酸 甘氨酸 丙氨酸  8.6  6.0  0.0  5.5  5.8  14.3  5.7  半胱氨酸  缬氨酸  蛋氨酸  异亮氨酸  酪氨基  苯丙氨酸  赖氨酸  组氨酸  色氨酸  精氨酸  亮氨酸  22.8  0.0  2.8  5.6  0.0  5.9  5.7  0.0  0.0  8.5  2.8

实施例7：重组蝎神经胶质瘤肽N末端氨基酸序列测定

样品使用Applied Biosystems 476A测序仪进行Edman降解，用AppliedBiosystems Model120APTH-分析仪分析得到的PTH氨基酸。结果表明N末端九个氨基酸顺序为“CGPCFTTDA”。

实施例8：急性毒性试验

选用18-22g健康昆明小白鼠(体重相差不超过4g)60只，随机分为5组，每组12只小白鼠，雌雄各半，rBmKCT融合蛋白腹腔注射后观察动物反应，正常饲养2天。结果显示LD₅₀＝245.1mg/kg，表明BmKCT融合蛋白对哺乳动物毒性很低。

表3

  组  别  实验动物  (只)  剂量  (mg/kg)  LgD  动物死亡  (只)  死亡率  (％)  1  2  3  4  5  12  12  12  12  12  600  420  294  206  144  2.7782  2.6232  2.4683  2.3139  2.1584  12  11  8  3  1  100.00  91.67  66.67  25.00  8.33

LD₅₀＝log^-1〔X_m-i(∑P-(3-P_m-P_n/4))〕＝245.1mg/kg

实施例9：重组蝎抗神经胶质瘤肽生理活性检测

用全细胞膜片钳的方法对重组肽的活性进行检测。U251星型胶质瘤细胞的制备：将涂上多聚赖氨酸的盖玻片放入24孔培养板中，再接种适量细胞，以含10％胎牛血清的DEME培养液37℃培养，当生长24～36小时后，以细胞间互不接触为原则，将玻片取出放入膜片钳的样品槽中，用细胞外液洗三遍，再加入细胞外液，以备测量。膜片钳操作的外液(mM)：NaCl 125，KCl 5，MgSO₄ 1.2，CaCl₂ 1.0，Na₂HPO₄ 1.6，NaH₂PO₄ 0.4，Glucose 10.5 and HEPES 32.5，用1mM NaOH调至pH 7.4。内液(mM)：KCl 145，MgCl₂ 1，CaCl₂ 0.2，EGTA 10 and HEPES 10，用1mM KOH调至pH 7.2。钳制电压为0mV，测试电压为-105mV-+170mV，步增长为10mv，刺激频率0.5Hz，15-20℃进行。应用EPC-9放大器和Pulse/Pulsefit软件(HEKA elektronik，Germany)。电压刺激神经胶质瘤细胞并记录氯通道电流，然后加入重组蝎抗神经胶质瘤肽，再记录氯通道电流，氯通道电流明显减少，表示此重组肽具有活性，见附图5。

实施例10：重组BmKCT融合蛋白对大鼠C6细胞皮下移植瘤的抑瘤作用研究

使用大鼠C6细胞皮下移植瘤模型研究了重组BmKCT融合蛋白抑制肿瘤的作用，结果表明，两组动物皮下肿瘤平均重量分别为：生理盐水组1.924g，rBmKCT组0.735g，rBmKCT融合蛋白实际抑瘤率为61.8％，统计学分析也显示两组间肿瘤均重差异极显著，显示rBmKCT融合蛋白具有很强的抑瘤效果。(见附图6)

实施例11：重组BmKCT蛋白对神经胶质瘤细胞的特异靶向性研究

使用大鼠皮下C6细胞移植瘤动物模型，尾静脉注射¹³¹I-rBmKCT融合蛋白，对照组注射Na¹³¹I。在不同时间分别取血液、心脏、肺脏、肝脏、肾脏、胰脏、胃脏、大脑、肌肉和肿瘤组织块作为样品，测定样品的放射脉冲数。统计分析发现，在180分钟内，荷瘤大鼠肿瘤组织内¹³¹I-rBmKCT的含量随时间的延长而不断增加(富集)，而其它非肿瘤组织则不具有这种作用，表明重组BmKCT蛋白对由C₆细胞所诱发的肿瘤组织有明显的特异亲和作用，或者说神经胶质瘤细胞(C6细胞)及其移植瘤组织细胞具有能与rBmKCT特异相互作用的蛋白质(配体)。rBmKCT与神经胶质瘤这种特异的相互作用正是rBmKCT蛋白作为抗神经胶质瘤靶向药物的基础。图7示荷瘤大鼠肿瘤组织内¹³¹I-rBmKCT的含量随时间的延长而不断增加(富集)。

实施例12：重组BmKCT蛋白药物干预颅内荷瘤试验

将成功制得的神经胶质瘤模型大鼠分为治疗组和对照组，分别将重组BmKCT多肽(1mg/Kg)及等体积的生理盐水注入大鼠脑内。于干预后第1、2、3周行MRI(核磁共振影像扫描)检查，发现治疗组肿瘤体积增长速度较对照组缓慢，其药物干预试验动物组的瘤体明显要小于对照试验动物组，且治疗组生存期可延长至30-35天，对照组28天内全部死亡。结果表明，在大鼠脑内，重组BmKCT蛋白具有明显抗脑神经胶质瘤细胞生长的功能。附图8为通过核磁共振成像检查发现，重组BmKCT多肽药物干预试验动物组的瘤体明显要小于对照试验动物组。

实施例13

安瓿剂：蝎抗神经胶质瘤肽  2mg

        NaCl              9mg

制备方法：将蝎抗神经胶质瘤肽和氯化钠溶解于1升注射水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例14

鼻喷雾剂：蝎抗神经胶质瘤肽  80mg

          NaCl              8mg

          EDTA              1mg

          硼酸缓冲液(pH6.5) 10mg

          多乙氧基醚        10mg

          重蒸馏水          定容至2ml

制备方法：在适当体积的重蒸馏水中每次加入一种成分，直至完全溶解，然后再加入下一种成分。定容至2ml后，将该溶液在无菌过滤器上过滤，装入瓶中并按照1ml/瓶分装。

实施例15

栓剂：蝎抗神经胶质瘤肽    10mg

      胆固醇              2％

      半合成脂肪酸酯      1.5g

        重蒸馏水            10％

制备方法：重组肽以适量蒸馏水溶解，用胆固醇吸收后，与70℃以下熔融的半合成脂肪酸酯1.5g混匀，制成栓剂。

实施例16

滴眼剂：蝎抗神经胶质瘤肽    4mg

        EDTA                0.5mg

        脱氧胆酸钠          1mg

        玻璃酸钠            1mg

        羟基苯甲酸乙酯      0.03mg

        硼酸缓冲溶液(pH7.4) 5mg

制备方法：用硼酸缓冲液溶解蝎抗神经胶质瘤肽，加入已溶解的EDTA和脱氧胆酸钠，不断搅拌下加入玻璃酸钠和羟基苯甲酸乙酯，充分混匀。

实施例17

脂质体制剂：蝎抗神经胶质瘤肽    10mg

            卵磷脂              240mg

            胆固醇              120mg

            双十六烷基磷酸酯    18mg

制备方法：用Z醚溶解胆固醇、卵磷脂，并加入双十六烷基磷酸酯，再加入重组BmKCT蛋白，超声处理(电流强度为0.1-0.5A)，使之成为稳定的W/O型乳浊液。在20℃-25℃下减压蒸发除去Z醚。加入5ml蒸馏水继续减压蒸发除去残余的乙醚。即制成带负电荷的脂质体混悬液。

                         SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种蝎抗神经胶质瘤肽及其制备方法和应用

<130>一种蝎抗神经胶质瘤肽及其制备方法和应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>261

<212>DNA

<213>Buthus martensii Karsch

<400>1

gcaaaactct attaaaaatg aagttcctct acggaatcgt tttcattgca ctttttctaa     60

ctgtaatgtt cgcaactcaa actgatggat gtgggccttg ctttacaacg gatgctaata    120

tggcaaggaa atgtagggaa tgttgcggag gtattggaaa atgctttggc ccacaatgtc    180

tgtgtaaccg tatatgaata attaaaaatg tacacctgaa cagatcattt aatgaataat    240

aaatattaat aagcattaaa a                                              261

<210>2

<211>43

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

gccggatccc cgatgacgat gacaagtgtg ggccttgctt tac                      43

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gccctcgagt catatacggt tacacagaca ttg                                 33

<210>4

<211>35

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<400>4

Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala Arg Lys Cys Arg

1               5                   10                  15

Glu Cys Cys Gly Gly Ile Gly Lys Cys Phe Gly Pro Gln Cys Leu Cys

            20                  25                  30

Asn Arg Ile

        35