BDNF在IL--1β影响大鼠海马神经元中的作用及其机制研究

摘要

背景:抑郁症是一种情感障碍性疾病，主要的临床特征是显著而持久的心境障碍。世界卫生组织统计数据显示，2020年抑郁症将上升为人类第二大致残性疾病。至今，全球对于抑郁症的病因及发病机制研究尚有待进一步完善。虽然提出了很多关于抑郁症病因的假说，但还没有哪一种解释抑郁症发病机制的假说能被大家信服。大量研究结果表明，在抑郁症的发生、发展过程中细胞因子起到了至关重要的作用。 海马不仅是人类情感、学习以及记忆等多种高级神经活动的重要结构，也是大脑边缘系统的重要组成部分。大量影像学及尸检研究结果显示，海马体积减小、神经元数量减少以及海马神经元树突结构的改变是抑郁症患者及抑郁症动物模型的共同特点。大脑海马神经元结构、功能的基础是细胞骨架，其主要成分就是具有极性结构和动态不稳定性特点的微管、微丝，它们能在细胞内外不同刺激作用下发生快速聚合/解聚，通过这样的转换来维持细胞骨架的结构和功能。 除红细胞外，其他所有的微管均由微管蛋白组成，包括分子量约为55kD的α及β微管蛋白，是细胞骨架的架构主干。一般情况下，微管蛋白存在的形式是异二聚体，且微管蛋白原纤维的聚合方式是首尾相连。微丝同时也是真核细胞中普遍存在的实心状纤维，其存在的形式主要是单体(G-actin)和纤维状(F-actin)，具有收缩、支持、非肌性运动和信息传导等许多种功能。 细胞因子是免疫活性细胞所分泌出来的信号分子，其作用表现在具有调节免疫应答的生物活性，按照细胞因子在炎症反应中作用的不同，可以分为两类:炎性细胞因子和抗炎性细胞因子。其中，炎性细胞因子的主要作用是参与炎症的反应过程，例如:IL-1，IL-6，IFN-γ和TNF-α，但抗炎性细胞因子所起到抗炎作用，则是通过抑制细胞的活化、炎性调节因子的产生从而抑制免疫应答，例如:IL-4，IL-10，IL-13等。外周细胞因子一般是通过免疫激活产生，当机体受到躯体应激、心理应激以及免疫干预等多种作用时，机体的免疫系统被激活，单核-巨噬细胞系统活性增强从而IL-1等一系列前炎症细胞因子水平升高。有研究证实，中枢神经系统中同样存在许多细胞因子。IL-1等多种细胞因子正常情况下是星形胶质细胞以及各种小胶质细胞在各类应激和损伤刺激作用下所产生的，进而引起机体的一系列生理生化的改变。关于遗传、动物行为及临床等方面的研究，大量文献显示，前炎症细胞因子（如血清IL-1等）的含量与抑郁、认知受损的风险及抑郁的治疗效果存在着密切的关系。经大量的临床观察研究发现，很多慢性非感染性免疫性疾病常常伴发抑郁症状，如多发性硬化、风湿性关节炎、过敏性疾病等，且患者脑脊液中IL-1β的增加与抑郁的严重程度也存在相关关系。动物研究证实，脂多糖(LPS)可以有效刺激如IL-1一类的前炎症细胞因子的产生和分泌。以LPS免疫激活模型为背景，LPS的刺激导致实验大鼠活动减少、性能力减弱、体温升高、食欲减退以及探索周围环境的兴趣下降，而可以有效抑制LPS所诱导的大鼠快感缺失的治疗就是抗抑郁。 总之，细胞因子不仅可以促进很多躯体疾病的发生和发展，很有可能也是抑郁症本身的病理生理基础。有关细胞因子与抑郁症的关系的动物实验和临床研究已明确显示细胞因子在抑郁症的发生、发展中具有重要作用，然而，细胞因子导致抑郁样行为的过程是怎样的，其发生的分子机制又是什么？至今，有关细胞因子对海马神经元细胞骨架的影响以及其信号转导机制的相关性研究少见，本课题组前期的研究表明细胞因子是通过改变海马神经元细胞骨架，从而导致海马结构、功能发生异常，最后出现抑郁症状，但细胞因子如何影响海马神经元细胞骨架，其作用机制是什么，通过了哪些信号传导通路，这些问题都未被一一阐明。 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是德国的神经生物学家Barde及其同事于1982年从猪脑的提取液中首次纯化并发现的一种具有神经营养作用的蛋白质，是神经营养素家族的重要成员之一，具有防止神经元死亡，促进脑损伤的修复的功能。BDNF与抑郁症的相关性是近年来研究的热门话题。尽管将BDNF直接应用于抑郁症治疗尚未见到报道，但是，诸多研究表明有效的抗抑郁治疗能够提高脑内BDNF的含量，抑郁症明显存在脑内BDNF含量降低，充分显示BDNF与抑郁症的发生有密切关联。但就BDNF与抑郁症之间的关联还存在很多争议，研究结果也存在矛盾性。BDNF是否参与到细胞因子介导的海马神经元细胞骨架改变？其参与机制是什么？都有待我们去探索。 综上所述，我们应用IL-1β刺激体外培养的大鼠海马神经元，探索BDNF是否参与IL-1β对海马神经元细胞骨架的影响，并初步探讨了其作用机制，对认识抑郁症的发生发展过程具有重要意义。 目的:探讨BDNF在IL-1β对海马神经元影响中的作用，并初步探讨其可能的作用机制。 方法:(1)对原代海马神经元进行培养、纯化及鉴定。(2)研究分组:(a)对照组:空白对照+0.9％氯化钠;(b)实验组(0.01ng/ml):IL-1β浓度为0.01ng/ml;(c)实验组(0.1ng/ml):IL-1β浓度为0.1ng/ml;(d)实验组(1ng/ml):IL-1β浓度为1ng/ml;(e)实验组(10ng/ml):IL-1β浓度为10ng/ml;(f)实验组(20ng/ml):IL-1β浓度为20ng/ml;(g)实验组(50ng/ml):IL-1β浓度为50ng/ml;(h)实验组(100ng/ml):IL-1β浓度为100ng/ml。(3)对海马神经元进行活性检测。(4)使用细胞免疫化学的方法对IL-1β进行检测，了解其对海马神经元形态结构的影响。(5)应用ELISA和Western blot方法检测IL-1β对海马神经元BDNF分泌及表达的影响。(6)应用Western blot方法检测BDNF参与IL-1β对海马神经元细胞骨架影响的信号通路。 结果:(1)不同浓度IL-1β刺激神经元生长发育结果:当IL-1β浓度分别为0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml时，促进神经元发育、生长最明显的是浓度为0.1ng/ml时，以神经元树突伸长、分支增加以及棘突增多表现最为突出;而随着IL-1β浓度的升高，导致海马神经元逐渐出现抑制作用，如棘突数目减少、消失，神经元分支减少、缩短，神经元树突出现萎缩，甚至断裂，或者死亡等表现。当IL-1β浓度控制在0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml时，一、二、三级突起均存在增加;当IL-1β浓度控制在10ng/ml--100ng/ml时，突起数与IL-1β的浓度成反比。 (2)不同浓度IL-1β刺激神经元活性结果:当IL-1β浓度控制在0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml时，对海马神经元的活性所产生的促进作用很明显，IL-1β浓度为0.1ng/ml时，其对海马神经元活性的促进作用最高，且存在统计学意义(P＜0.01);IL-1β的浓度与对海马神经元活性的抑制作用成反比，且存在显著的统计学意义(P＜0.01)。 (3)IL-1β对F-actin的分布所产生的影响:细胞免疫化学染色结果说明，IL-1β浓度为0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml时，神经元各级突起数与对照组比较，在浓度为0.1ng/ml时增加最明显，神经元的一级突起数增加不显著，二级、三级突起数均存在明显增加和延长;当IL-1β的浓度增加至10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml时，海马神经元突起开始转为减少，二级、三级突起表现为短小，甚至消失。IL-1β低浓度时，F-actin在整个胞体和突起中的分布增加，尤其以突起的末端增加更为显著;高浓度IL-1β时，F-actin在海马神经元内分布表现为剂量依赖性减少，以突起远端更显著。 (4)不同浓度IL-1β刺激神经元后BDNF的变化:低浓度的IL-1β可以使神经元BDNF分泌显著增加，与对照组相比结果存在显著的统计学差异(P＜0.01)，而当IL-1β浓度逐渐升高，BDNF分泌很快出现降低，与对照组比较存在显著统计学差异(P＜0.01)。 (5)信号通路的改变:当IL-1β的浓度为0.01ng/ml时，NF-kB表达与对照组相比较低;浓度为0.1ng/ml时，与浓度为0.01ng/ml时比较，蛋白表达水平更低;而IL-1β浓度在0.1ng/ml时，NF-kB的表达与对照组比较存在显著统计学差异(P＜0.01);浓度在1ng/ml时，NF-kB的表达与对照组比较存在统计学差异(P＜0.05)。随着IL-1β浓度的升高，NF-kB的表达较对照组有所升高，当浓度为20ng/ml、50ng/ml时实验组与对照组比较存在统计学差异(P＜0.05)。 结论:低浓度IL-1β刺激海马神经元的存活率升高，刺激突起的生长、发育，其可能机制与增加BDNF的分泌相关;高浓度IL-1β降低海马神经元的存活率，抑制突起的生长、发育，其可能机制与抑制BDNF分泌相关;BDNF可能通过NF-kB信号转导通路影响海马神经元的存活。

目录

声明

摘要

第一部分海马神经元培养及鉴定

前言

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分BDNF在IL-1β对海马神经元影响中的作用

前言

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分BDNF在IL-1β对海马神经元影响中的作用机制

前言

材料与方法

实验结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 脑源性神经营养因子与抑郁症的相关性的研究

中英文对照表

发表的文章

参编著作

致谢