LncRNA HOTAIR通过miR--214调控HPV16型阳性宫颈癌细胞增殖及凋亡的机制研究

摘要

目的： 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，近年来其发病有明显年轻化的趋势，严重危害着女性的健康及生命。高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要危险因素，其中以HPV16和18型感染为主。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一种长度为200-100000个核苷酸的非编码RNA，其功能复杂多样，可以在表观、转录及转录后水平对基因进行调控，在肿瘤的发生发展中具有重要的作用。lncRNA HOTAIR(HOX transcript antisense RNA，HOX转录反义基因)是第一个被发现具有反式调控作用的lncRNA，在宫颈癌中呈显著高表达状态，本研究主要关注HOTAIR作为竞争性的内源RNA在HPV16型阳性宫颈癌细胞中，通过miR-214对细胞的增殖及凋亡的调控作用以及相关机制。 方法： 1.培养HPV阴性的C-33A细胞、HPV16型阳性的宫颈癌SiHa细胞、转化了HPV16型E6和E7后永生化的宫颈上皮End1/E6E7细胞，采用实时荧光定量PCR法分别检测这三种细胞系中HPV16E7、HOTAIR、miR-214的表达水平。 2.为了探究HOTAIR及miR-214对三种细胞系增殖和凋亡的影响，在C-33A、End1/E6E7、SiHa细胞中分别转染针对HOTAIR的小干扰RNA、miR-214mimics以及阴性对照RNA，采用CCK8以及EdU掺入法检测细胞增殖的改变，细胞凋亡水平由流式细胞仪法进行检测。 3.使用starbase v2.0预测HOTAIR与miR-214结合的位点，采用双荧光素酶报告系统实验验证结合位点。 4.C-33A、End1/E6E7、SiHa细胞中分别敲降HOTAIR的表达，以及在C-33A细胞中过表达HOTAIR以后，实时荧光定量法检测miR-214表达量的变化，另外在这三种细胞系中分别敲降和过表达HPV16E7以后检测HOTAIR及miR-214表达水平的变化。 5.用TargetScan7.2、PicTar、MirTarget2分别预测miR-214的靶基因，并取三者结果的交集作为候选靶基因，并使用DAVID数据库对候选靶基因进行富集功能和通路分析，接着在C-33A、End1/E6E7、SiHa细胞中敲降HOTAIR及过表达miR-214，并单独在C-33A细胞中过表达HOTAIR以后检测β-catenin的mRNA及蛋白水平的变化。 结果： 1.实时荧光定量结果显示，与HPV阴性C-33A细胞相比，End1/E6E7及SiHa细胞中HPV16E7及HOTAIR呈显著高表达水平(P＜0.01)，而miR-214则呈显著低表达水平(P＜0.001)。 2.CCK8及EdU细胞增殖实验及凋亡流式检测结果显示，在End1/E6E7、SiHa细胞中敲降HOTAIR及过表达miR-214以后，细胞的增殖水平受到显著抑制(P＜0.05)，细胞凋亡水平明显上升(P＜0.05)，而C-33A细胞则几乎不受影响;但在C-33A细胞中过表达HOTAIR以后，细胞增殖能力显著上调(P＜0.01)，凋亡水平明显下降（P＜0.05）。 3.starbase v2.0预测出HOTAIR与miR-214的结合位点在HOTAIR variant1上1794-1814bp的位置，接着采用双荧光素酶报告系统实验进行验证，在转染miR-214mimics以后，荧光信号显著下降(P＜0.01)，证实HOTAIR上存在miR-214的结合位点。 4.在End1/E6E7、SiHa细胞中敲降HOTAIR的表达以后，miR-214的表达显著上调(P＜0.001)，而C-33A细胞则无明显变化(P＞0.05)，而当在C-33A中过表达HOTAIR以后，miR-214的表达则显著下调(P＜0.05);当在这三种细胞中敲降HPV16E7以后，End1/E6E7、SiHa细胞中HOTAIR的表达显著下调(P＜0.05)，与此同时miR-214的表达呈显著上调趋势(P＜0.05)，C-33A细胞中无明显变化（P＞0.05）;当在C-33A、End1/E6E7、SiHa细胞中过表HPV16E7后，三种细胞中HOTAIR的表达量均显著上升(P＜0.05)，同时miR-214表达量显著下降(P＜0.05)。 5.通过对miR-214的靶基因的预测以及相关生物信息学分析发现miR-214的靶基因显著富集于Wnt信号通路(P＜0.001)，其中β-catenin为miR-214的下游靶基因，在End1/E6E7、SiHa细胞中敲降HOTAIR及过表达miR-214以后，β-catenin的mRNA及蛋白水平均显著下调(P＜0.05)，在C-33A细胞中过表达HOTAIR以后，β-catenin的mRNA和蛋白水平显著上调(P＜0.05)。 结论： HOTA IR在HPV16型阳性的宫颈癌中呈显著高表达水平，HOTAIR可以作为竞争性的内源RNA，通过竞争与miR-214结合，诱导上调β-catenin的表达，从而促进HPV16型阳性宫颈癌的发生和发展。HOTAIR可以作为HPV16型阳性宫颈癌的潜在治疗靶点以及预后评估的指标。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分lncRNA HOTAIR及miR-214对HPV16型阳性细胞增殖及凋亡的影响

1．1实验材料

1．2实验方法

1．3实验结果

1．4讨论

1．5结论

第二部分HOTAIR与miR-214的相互作用研究

2．1实验材料

2．2实验方法

2．3实验结果

2．4讨论

2．5结论

第三部分HOTAIR通过结合miR-214调控β-catenin的表达

3．1实验材料

3．2实验方法

3．3实验结果

3．4讨论

3．5结论

参考文献

综述 宫颈癌的筛查与治疗以及HPV疫苗发展现状

攻读硕士学位期间发表的科研成果

致谢