靶向损毁心交感神经元对犬心肌梗死后心脏重构的影响及其机制研究

摘要

心脏性猝死(sudden cardiac death, SCD)仍然是威胁人类生命健康的主要原因之一，而大多数SCD患者直接死亡原因是心肌梗死(myocardial infarction，MI)后出现的恶性室性心律失常。近年来，大量研究表明:MI后出现的交感神经功能上调是MI患者出现恶性心律失常和SCD的主要原因;而且，通过抑制交感神经功能可以显著减少MI后室性心律失常的发生。另外，自主神经平衡紊乱是心力衰竭(heart failure，HF)患者的主要特征，表现为交感神经张力增加，迷走神经活性降低及体内神经内分泌的过度激活。交感神经过度激活在不良的心脏重塑和功能障碍及HF进程中起至关重要的作用。交感神经切除术和星状神经节阻滞已被证实是防治HF患者室性心律失常和心功能不全的有效方法。 β受体阻滞剂是目前广泛应用的抑制交感神经活性的药物，也是抑制MI后室性心律失常事件和改善HF预后的主要药物，然而，除了需长期使用外，部分患者存在禁忌症或难以耐受外。除此之外，近年来涌现出了大量的自主神经调节治疗方法，如迷走神经刺激、脊神经刺激、主动脉窦压力感受器刺激。虽然基础研究基本都证实它们对抑制缺血诱导的室性心律失常事件有效，但是临床研究结果并不令人满意。本研究中使用的霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit，CTB)与肥皂草素（sapori，SAP）的轭合物CTB-SAP是一种靶向损毁心交感神经元（targeted ablation of cardiac sympathetic neurons，TACSN）的药物。SAP是一种核糖体失活蛋白，可以结合细胞内核糖体并使之失活，抑制细胞蛋白质的合成，使细胞发生凋亡。SAP可以与逆轴突运输分子CTB结合，后者可以与神经细胞膜上特异的膜成分结合。CTB-SAP星状神经节注射后，可以与交感节前神经元细胞膜上的神经节苷脂结合，选择性地消融交感节前神经元，从而减少星状神经节内交感节后神经元的数目。因此，本研究探讨左侧星状神经节(left stellateganglion，LSG)内注射CTB-SAP靶向损毁心交感神经元后对犬MI后心室电重构及结构重构的影响，并探讨其可能的机制。以期为MI后室性心律失常和不良心肌重塑及HF进程提供新的治疗策略。 第一部分:靶向损毁心交感神经元对犬心肌梗死后心室电重构的影响及机制研究 目的: 探讨TACSN对犬心肌梗死后心室电重构的影响，并探讨其可能的作用机制。 方法: 将38条成年雄性杂种犬随机分为假手术组（n=8只）、MI组(n=15只)及MI-TACSN组(n=15只)。MI模型制备是利用经微导管在冠状动脉前降支内注射明胶海绵颗粒栓塞剂构建。MI造模后1周，在左侧星状神经节(left stellateganglion，LSG)内注射CTB-SAP靶向损毁心交感神经元。MI术后5周，记录5分钟体表心电图进行心率变异性分析，包括时域分析:SDNN，频谱分析:LF(nu)、HF(nu)及LF/HF。利用Powerlab数据采集系统记录LSG神经活性，并利用Labchart8软件进行数据分析，采用高频电刺激LSG，通过观察不同刺激电压引起的股动脉收缩压的上升幅度来评价LSG功能。利用程控刺激测定心室梗死周边区、正常区、左室基底部、右室心尖部、右室中部及右室基底部有效不应期;利用自制电极记录上述6个部位的心外膜的单向动作电位(monophasic actionpotential，MAP)，并计算动作电位复极完成90％的时间(APD90);利用S1S1动态起搏方法记录不同起搏周长下不同部位的APD90与对应的舒张间期(diastolicinterval，DI)，并构建动作电位回复曲线，测定APD交替阈值;利用burst刺激测定室颤阈值(ventricular fibrillation threshold，VFT)。利用免疫荧光技术测定梗死周边区络氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、生长相关蛋白-43(growthassociated protein-43，GAP43)阳性神经纤维的表达;利用酶联免疫吸附技术测定血清中去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)和脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)水平;利用醋酸甲酚紫染色对LSG内神经元进行计数。 结果: 与假手术组比较，MI组HRV时域分析SDNN显著降低，频谱分析LF(nu)、LF/HF值显著增加，而HF(nu)显著降低;而与MI组比较，TACSN显著增加SDNN和HF(nu)，降低LF(nu)和LF/HF。与假手术组比较，MI后LSG神经活性明显上调，放电频率和放电幅值均增加，以20-70伏的电压高频刺激LSG后，动脉收缩压上升幅度显著增加;而与MI组比较，MI-TACSN组神经放电频率和幅度显著降低，相同电压高频电刺激LSG引起动脉收缩压的改变显著降低。另外，与MI组比较，TACSN可以显著延长QTc间期，降低Tpeak-Tend间期，延长心室上述各个部位ERP和APD90，并降低ERP和APD90的空间离散度，降低梗死周边区动作电位回复曲线的最大斜率(Smax)，并降低Smax的空间离散度，降低梗死周边区APD交替阈值，增加VFT。此外，与MI组比较，TACSN可以显著降低MI后血清中NE、NGF、BNP的水平，减少LSG内神经元数目，并降低梗死周边区心肌组织TH、GAP43阳性神经纤维支配密度。 结论: TACSN可以显著改善MI后心室电生理性质，具有潜在的抗室性心律失常作用;其发挥作用可能是通过改善MI后心脏的神经重构来实现的。TACSN或许可以成为治疗MI后室性心律失常的新的策略。 第二部分:靶向损毁心交惑神经元对犬心肌梗死后心室结构重构的影响及机制研究 目的: 探讨TACSN对犬MI后不良心脏结构重构的影响，并阐明其可能的机制。 方法: 将38条成年雄性杂种犬随机分为假手术组（n=8只）、MI组(n=15只)及MI-TACSN组(n=15只)。MI模型制备是利用微导管在冠状动脉前降支内注射明胶海绵颗粒栓塞剂构建。MI造模后1周，在LSG内注射CTB-SAP靶向损毁心交感神经元。MI术后5周，利用超声心动图测量左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、左室舒张末容积(LVEDV)、左室收缩末容积(LVESV)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)。将一导管置入左室内测量左室血流动力学指标，包括左室收缩末压(LVESP)，左室舒张末压(LVEDP)和左室压力/时间曲线的最大的dp/dt(max dp/dt)。利用HE和天狼猩红染色分别评价梗死周边区心肌细胞的横截面积和心肌组织胶原沉积。利用免疫荧光技术评价梗死周边区心肌组织TH、GAP43阳性神经纤维再生情况。利用醋酸甲酚紫染色评价LSG内神经元数目。利用qRT-PCR技术检测梗死周边区心肌组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ、转化生长因子-β(TGF-β)和结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA的表达量。利用Western blotting技术检测梗死周边区心肌组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β、CTGF及β1肾上腺素受体(β1AR)的蛋白表达水平。利用ELISA检测血清及梗死周边区心肌组织中NE，NGF,心房钠尿肽(ANP)，BNP,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，高敏C反应蛋白(hs-CRP)及醛固酮(ALD)的水平。 结果: 与MI组比较，MI-TACSN组LVEF，LVFS，LVESP及max dp/dt显著增加，LVESD，LVESV和LVEDP显著降低。与MI组比较，TACSN可以显著抑制梗死周边区心肌细胞肥大，减轻心肌组织胶原纤维沉积，并降低CollagenⅠ，CollagenⅢ，TGF-β及CTGF的mRNA和蛋白表达水平。这些结果表明:TACSN可以显著改善MI后心脏结构重构。另外，与MI组比较，TACSN可以显著减轻梗死周边区TH和GAP43阳性神经纤维支配密度，恢复β1AR的表达水平，并减少LSG内神经元数目。此外，与假手术组相比较，MI组血清和组织中NE，NGF, AngⅡ，ALD，ANP, BNP和hs-CRP的水平显著上调，然而，在MI-TACSN组中，这些指标的水平显著降低，并接近正常值水平。这些结果预示着:TACSN可以显著减弱交感神经张力，并抑制RAAS系统的活性，改善心脏功能。 结论:TACSN可以显著改善MI后不良的心脏结构重构，延缓心力衰竭发展进程。其发挥作用在一定程度上可能是通过减弱交感神经重构和神经内分泌系统功能来实现的。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词索引

引言

第一部分TACSN对犬心肌梗死后心室电重构的影响及机制研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

第二部分靶向损毁心交感神经元对犬心肌梗死后心室结构重构的影响及机制研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

全文总结

附图表

参考文献

综述

博士期间发表的文章

致谢