局部给予华蟾素对H22足部荷瘤小鼠癌痛行为的影响及其外周机制研究

摘要

目的:本课题旨在建立小鼠后足癌痛模型基础之上,观察华蟾素对模型小鼠癌痛行为的影响及外周机制研究,为华蟾素临床治疗癌痛提供理论依据。
　　方法:实验一:小鼠癌痛模型的制作:选用体重18～20g雌性昆明小鼠,随机分为正常组(左足底注射0.1ml生理盐水)和模型组(左足底注入 H22肝癌细胞悬液0.1ml含肿瘤细胞0.6×107个)。记录每只小鼠体重及造模前、造模后第2、4、6、8天痛阈值变化,随后按一定时间处死小鼠取其左后足做 HE染色,进行形态学观察。实验二:局部给予华蟾素对癌痛模型小鼠癌痛行为的影响研究；另取112只雌性昆明小鼠随机分为对照组16只、造模组96只,待造模成功后小鼠再随机分为模型组、基质组、吗啡组及华蟾素腹腔注射组、外用组、瘤周注射组。从造模第9天给药,连用8天。记录各组小鼠给药前、第1次给药后0.5、1.0、1.5、3、6小时以及给药后第2、4、6、8天测定的痛阈值。给药第8天痛行为测定结束后,眼球取血,颈椎脱臼处死动物后,取脾和胸腺并称重,计算脾和胸腺指数,留取左后足肿瘤病变组织标本。采用ELISA法检测肿瘤病变组织和血液中CRF、IL-1β和β-END的含量;应用免疫组化检测肿瘤病变组织中POMC、β-END、μ-OR受体蛋白的表达;采用免疫荧光检测肿瘤病变组织中CD3+、CD4+、CD8+细胞蛋白的表达。
　　结果:实验一:小鼠后足癌痛模型的制作:随着足部肿瘤增大,自主活动降低,期间可见自发抬足、跛行蜷缩等自发性痛行为;后足形态学观察,左后足癌细胞逐步侵润最终至骨,足部荷瘤小鼠成瘤率100％。与造模前相比,癌痛模型小鼠热刺激、机械性痛阈值逐渐降低,造模第2天热刺激痛阈值降低(P<0.05),第4天热刺激、机械力痛阈值均明显降低(P<0.01)。模型组小鼠造模第2、4、6、8天热刺激、机械力刺激痛阈值较正常组均降低(P<0.01)。实验结果证实:该癌痛模型制备较为成功,可作为研究癌痛的工具。实验二:(1)给药后痛行为测定:第1次给药,各用药组给药0.5、1.0、1.5、3、6小时热刺激和机械力痛阈值升高(分别与用药前及模型组比较:P<0.05或P<0.01);连续给药8天后,各用药组给药后第2、4、6、8天机械力痛阈值升高(与用药前比较:P<0.01,与模型组比较:P<0.01)。(2)脾和胸腺指数测定:模型组小鼠脾指数较正常组显著降低(P<0.01);各用药组模型小鼠脾指数较模型组显著提高(P<0.01或P<0.05)。胸腺指数组间比较差异无统计学意义。(3)肿瘤病变组织和血液中IL-1β、CRF、β-END含量测定:①组织中:与正常组比较,模型组肿瘤病变组织中CRF、IL-1β含量显著增高(P<0.01),β-END含量降低(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,华蟾素瘤周注射组、外用组、腹腔注射组肿瘤病变组织中β-END、CRF含量显著提高(P<0.05或P<0.01),IL-1β含量降低(P<0.05或P<0.01)。②血液中:与正常组比较,模型组血液CRF、IL-1β含量显著增高(P<0.01),β-END含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,吗啡组、华蟾素外用、腹腔注射组血浆β-END含量显著升高(P<0.01),吗啡组CRF含量显著降低(P<0.01),余下用药组血浆β-END、CRF、血清IL-1β含量差异均无统计学意义。(4)肿瘤病变组织中POMC、β-END、μ-OR受体蛋白表达:免疫组化显示,模型组肿瘤病变组织POMC、β-END、μ-OR受体表达较正常组显著下降(P<0.01);与模型组比较,吗啡组肿瘤病变组织μ-OR受体表达显著升高(P<0.01),而POMC、β-END表达差异无统计学意义;其余用药组POMC、β-END、μ-OR受体表达显著升高(P<0.01或P<0.05)。(5)肿瘤病变组织中CD3+、CD8+、CD4+细胞蛋白表达:免疫荧光显示,与模型组比较,华蟾素瘤周注射、外用组CD4+细胞蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01),而吗啡组、华蟾素腹腔注射组差异无统计学意义,华蟾素瘤周注射、外用、腹腔注射组肿瘤病变组织CD3+、CD8+细胞蛋白表达均明显升高(P<0.01),吗啡组CD3+、CD8+、CD4+细胞蛋白表达差异均无统计学意义。(6)华蟾素三种给药方式(瘤周注射、外用涂抹、腹腔注射)两两比较主要阳性结果:①痛行为:初次给药,各组间机械力痛阈值差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05),其中华蟾素腹腔组机械力痛阈值升高最明显,瘤周组其次,外用组再次;华蟾素腹腔注射组初次给药0.5h热刺激、机械力痛阈值明显高于瘤周注射、外用组(P<0.01)。②肿瘤病变组织中:华蟾素瘤周组β-END分别较腹腔组、外用组含量较少(P<0.01)。华蟾素外用组CD4+细胞蛋白分别较瘤周注射、腹腔注射组表达量较低(P<0.01)。华蟾素瘤周注射组CD8+细胞蛋白较腹腔注射组表达较高(P<0.01)。
　　结论:(1)本研究采用H22肝癌细胞制作小鼠足部癌痛模型方法操作简单易行,成瘤率高,具有热、机械性痛觉过敏,逐步加重,有患肢抬脚、外翻等自发性痛行为和“镜像痛”人类进展性溶骨骨癌的终末表现,证实癌痛模型的制作较为成功,为本实验后续进行华蟾素抗癌痛的外周作用及机制研究提供了坚实的基础。(2)华蟾素对模型小鼠癌痛有一定的缓解作用,其机制与提高肿瘤局部病变组织β-END的含量有关,同时华蟾素对 TIL有一定的促进作用。通过华蟾素外用(含基质组)、腹腔注射组佐证进行纵向比较,并进一步将华蟾素的三种给药方式(瘤周注射、外用涂抹、腹腔注射)进行两两比较,检测指标说明华蟾素镇痛作用是通过外周局部来发挥的,但肿瘤局部病变组织β-END是否来自于 TIL(或具体何种类型)本课题组正在通过后续研究进一步确证。

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引 言

第一部分 小鼠 H22 肝癌细胞后足癌痛模型的制作

材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

1.3 观察项目

1.4 实验数据统计方法

结果

1.1 对行为体征的影响

1.2 痛阈值测定结果

1.3 后足形态学检测

第二部分 局部给予华蟾素对癌痛模型小鼠癌痛行为的影响及外周机制

材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 观察项目

2.4 统计学处理

结果

2.1 行为体征观察结果

2.2 痛行为测定结果

2.3 华蟾素对癌痛小鼠脾和胸腺指数的影响

2.4 华蟾素对癌痛模型小鼠肿瘤组织匀浆和血浆 β-END、CRF 和IL-1β 的影响

2.5 华蟾素对癌痛模型小鼠左后足肿瘤病变组织 POMC、β-END、μ-OR 蛋白表达的影响

2.6 华蟾素对癌痛模型小鼠左后足肿瘤组织 CD3+、CD4+、CD8+蛋白表达的影响

2.7 华蟾素三种不同给药方式(瘤周注射、外用涂抹及腹腔注射)各种实验检测指标结果两两比较

讨论

1.1 关于本课题的研究思路

1.2 关于癌痛模型的建立

1.3 华蟾素治疗癌痛的机制探讨

小结

参考文献

综 述

后 记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著