肿瘤细胞中多胺代谢与Akt信号通路关系的研究

摘要

目的:多胺是一类带有正电荷的烷基胺类小分子,存在于所有细胞中。研究表明,肿瘤细胞的快速增殖高度依赖于细胞内的多胺含量,使用多胺耗竭试剂减少肿瘤细胞中的多胺能有效抑制肿瘤细胞增殖。DFMO作为多胺合成代谢限速酶鸟氨酸脱羧酶(ODC)的特异性抑制剂,它可在细胞水平上通过耗竭多胺而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,然而要达到上述抗肿瘤效应需要较高的药物剂量,在临床试验中,这种高剂量 DFMO所产生的毒副作用极大地限制了它在抗肿瘤治疗中的应用。最近有报道指出,DFMO处理可激活细胞内的PI3K/Akt信号通路,而该信号通路的活化可促进细胞增殖和拮抗细胞凋亡。因此我们推测,用 DFMO耗竭多胺可导致细胞代偿性上调 PI3K/Akt信号通路的活性,由此拮抗 DFMO对细胞增殖的抑制作用,这可能是DFMO需要高剂量方能抑制肿瘤细胞增殖且临床应用疗效不佳的重要原因。如果在用 DFMO耗竭多胺的同时还阻断细胞内的 PI3K/Akt信号通路,将可大幅度提高DFMO对肿瘤细胞的杀伤活性,降低药物用量和药物的毒副作用。
　　为验证上述假说,本研究以人A549肺癌细胞为研究对象,探讨多胺代谢通路与PI3K/Akt信号通路之间的相互关系,并通过联合使用DFMO与PI3K/Akt激酶抑制剂处理细胞,分析其对于肿瘤增殖是否有协同抑制效应。
　　方法:(1)使用高效液相色谱检测DFMO对于A549细胞中多胺含量的影响, western blotting检测DFMO对A549细胞中Akt磷酸化水平的影响;(2)构建显性负突变Akt真核表达质粒;(3)使用PI3K/Akt激酶抑制剂LY294002或转染显性负突变Akt真核表达质粒,分析降低Akt磷酸化水平对A549细胞中多胺含量的影响。(4)在用DFMO降低A549细胞中多胺含量的同时抑制Akt磷酸化水平,分析二者联用在抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡中的协同作用。
　　结果:(1)DFMO可显著降低A549细胞中腐胺、精脒、精胺的含量;(2)DFMO对细胞中Akt蛋白总量及Akt的Thr308磷酸化水平无明显影响,但可增加Akt的Ser473磷酸化水平,补充腐胺、精脒、精胺均可逆转DFMO引起的Ser473磷酸化水平增加;(3)成功克隆并构建野生型及显性负突变型Akt真核表达质粒;(4)使用PI3K/Akt激酶抑制剂LY294002或转染显性负突变Akt真核表达质粒在抑制Akt磷酸化的同时,还可显著降低A549细胞中的多胺含量;(5)降低Akt磷酸化水平可促进DFMO对A549细胞的增殖抑制及凋亡促进作用。
　　结论:用DFMO处理A549肺癌细胞导致的多胺水平下降可上调Akt-Ser473的磷酸化水平;单纯抑制PI3K/Akt信号通路也可降低细胞内多胺含量,提示多胺代谢与PI3K/Akt信号通路之间存在功能上相互制约的关系。与PI3K/Akt信号通路抑制剂联合应用能显著性增强DFMO对A549肺癌细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用。

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英文缩略词表

引言

材料与方法

1.1 仪器和设备

1.2 实验方法

结果

第一部分 多胺耗竭可使Akt磷酸化水平升高

1.1 DFMO降低A549细胞中多胺含量

1.2 DFMO诱导A549细胞中Akt-Ser473磷酸化水平升高

1.3 补充多胺可逆转DFMO引起的Akt-S473磷酸化水平升高

第二部分 野生型及显性负突变型Akt真核表达质粒的构建

2.1 野生人源性Akt基因的获取

2.2 构建野生型Akt真核表达质粒

2.3 构建显性负突变Akt真核表达质粒

第三部分 抑制Akt磷酸化可降低A549细胞内多胺含量

3.1 PI3K/Akt激酶抑制剂可降低A549细胞中多胺水平

3.2 高表达DNM-Akt可降低A549细胞中多胺水平

第四部分 与PI3K/Akt信号通路抑制剂联合应用增强DFMO的抗肿瘤效应

4.1 LY294002显著促进DFMO对A549细胞的生长抑制作用

4.2 Akt磷酸化抑制剂显著促进DFMO诱导的A549细胞凋亡

讨论

小结

参考文献

综述

致谢

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著