棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备

摘要

本文采用PCR方法，根据已知HaSNPV泛素基因设计上游引物和下游引物，克隆了棉铃虫核多角体病毒泛素基因。将该基因与pGEM-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5 α，通过酶切鉴定阳性克隆。该基因在原核细胞表达系统中成功地进行了高表达。将泛素基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上，成功构建了重组质粒pET-Ubi，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导表达融合蛋白，通过条带扫描分析表达量最高可达总蛋白的20﹪。用His-tag抗体检测目的蛋白，Westen-blot试验证明所表达的蛋白是带有His-tag的重组融合蛋白。对该基因的表达条件进行了优化，并利用纯化的蛋白制备了抗体。通过改变IPTG浓度和诱导时间，确定最佳表达时间为1h，且当IPTG浓度为1.0mmol/L时，融合蛋白表达量已接近最大。利用Ni-琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE鉴定为单一条带，纯度可达90﹪以上，利用提纯的蛋白制备了抗体，Westen-blot试验显示出了目的蛋白带。融合蛋白的纯化工作及抗体的制备为下一步的三维构像结构的测定提供材料，并为进一步的功能研究打下基础。

目录

文摘

英文文摘

华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明

Ⅰ前言

1.1杆状病毒简介

1.2泛素及泛素-蛋白酶水解系统的简介

1.3病毒编码的泛素蛋白的研究进展

1.4本研究的目的及意义

Ⅱ实验材料

2.1供试病毒和昆虫、菌株及质粒

2.2实验所用试剂

Ⅲ实验方法

3.1病毒的扩增，多角体的纯化和DNA的提取

3.2 HaSNPV泛素基因的PCR扩增与回收

3.3含HaSNPV泛素基因原核表达载体的构建

3.4诱导表达泛素融合及表达条件的优化

3.5泛素融合蛋白的分离纯化及抗血清的制备

Ⅳ结果及分析

4.1泛素基因的克隆与重组质粒的鉴定

4.2泛素融合蛋白的诱导表达与表达条件的优化

4.3表达产物的纯化

4.4泛素融合蛋白及特异性抗体的Western-blot检测

Ⅴ讨论

参考文献

硕士期间发表论文

致谢