棉花抗逆相关基因的克隆与功能研究及低温胁迫下棉花蛋白质差异表达分析

摘要

干旱、高盐和低温是影响作物生长、限制作物产量的重要的环境因素，严重时可以引起植株不可逆的伤害甚至死亡。应用分子生物学、分子遗传学等方法研究作物抗逆机制，找出抗逆基因，并通过基因工程手段培育优良的抗逆新品种是现代农业研究的重要内容。本研究以我国重要的经济作物棉花作为实验材料，分离和克隆了3个抗逆相关的基因，并对它们进行了表达分析和初步的功能研究。同时，利用双向电泳技术分析棉花幼苗在逆境胁迫下的蛋白表达差异。得到了以下的结果： 1．从30多个可能与棉花抗逆性相关的候选基因中筛选获得1个低温诱导表达的基因GhTIP1。该基因编码由251个氨基酸组成的蛋白质，含有水孔蛋白家族蛋白的特征序列HVNPAVTFG。与其它已知植物的水孔蛋白的同源性很高。其中与花椰菜和拟南芥的TIP蛋白同源性最高，分别达到了90％和88％。TIP是一种液泡膜蛋白，在水分运输中起作用。RT-PCR分析表明：该基因在根中高水平表达，在其它组织中表达量较低，并且在根中的表达受发育阶段调节。在干旱、高盐和低温胁迫下，该基因的表达均受到影响。且在不同的胁迫下及不同组织中，该基因的表达模式存在差异。特别是在低温胁迫下，该基因在子叶中表达量大幅度升高，而在根中却明显降低。这些都表明该基因在不同的组织中可能受不同的信号传导途径的调控。利用酵母过量表达GhTIP1，能有效的提高酵母在低温下的耐受性，但在渗透胁迫下没有明显的改善。推测GhTIP1可能作为一种新的基因资源用于改善作物的抗冻性。通过构建植物表达载体PBI121-GhTIP1，对烟草进行叶盘法转化，获得了转基因植株。并对转基因植株的抗盐性和抗冷性进行了分析。与对照植株相比，转GhTIP1基因的烟草在含有1.5％NaCl的培养基上更为敏感，但是转基因植株叶绿素含量在低温处理后降低幅度减小，推测，转基因植株的耐盐性降低而抗冷性增强。对于转基因植株的抗旱性分析实验也正在进行中。 2．同样的从上述的30多个基因中还筛选获得了两个Di19-Like蛋白基因，分别为GhDi19-1，GhDi19-2。它们分别编码由219，218个氨基酸组成的蛋白质，与其它已知Di19蛋白氨基酸序列具有较高的同源性。GhDi19-1在棉花各个组织中表达水平比较低，GhDi19-2表达较高。且GhDi19-2在棉花纤维中表达量最高。逆境胁迫实验表明：这两个基因受高盐诱导和干旱诱导，不受低温诱导。表明这两个基因在逆境胁迫下的表达模式存在相似性。选取GhDi19-1 做 Northern-blot实验表明，在高盐胁迫下 GhDi19-1 在子叶中的表达量迅速升高，并在一定时间段内维持较高的水平，在根中表达量无明显变化。为了研究这两个基因5’端调控序列差异，我们利用 Genome walker PCR 方法，调取这两个基因的启动子，并构建了GuS融合载体。为下一步研究这两个基因启动子的不同活性及在逆境胁迫下的不同调控方式奠定了基础。 3．采用TCA-丙酮沉淀法，改良优化了棉花蛋白质组研究中的双向电泳技术。通过对根和子叶全细胞蛋白的提取、蛋白的溶解、胶条的选择及电泳等环节的优化，得到了重复性很高、分辨率很好的蛋白质图谱。进一步对5天苗龄的棉花进行4℃低温处理12小时后，提取子叶的蛋白质，利用双向电泳技术分离全细胞蛋白，研究棉花在低温处理下子叶中蛋白表达谱的变化。并用PDQuest软件分析比较棉花子叶在低温处理下的蛋白表达谱，得到了50个有显著差异的蛋白点。其中，低温处理上调表达的蛋白点有28个，减弱表达的蛋白点有22个，推测这些差异蛋白点可能与低温胁迫相关，为研究棉花蛋白质组学奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略表

声明

第一章前言

1.1植物抗逆分子机制及其研究进展

1.1.1植物应对逆境的分子机制

1.1.2植物对逆境胁迫信号的传导途径

1.1.3植物逆境胁迫应答的基因表达调控

1.1.4植物基因工程提高植物的抗逆性

1.2植物蛋白质组学研究进展

1.2.1蛋白质组学产生的背景及其研究内容

1.2.2蛋白质组学研究的相关技术和方法

1.2.3蛋白质组学在植物抗逆研究中的应用

1.2.4展望

1.3立题依据及研究意义

第二章棉花水孔蛋白GhTIP1的克隆及功能分析

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1植物材料

2.2.2菌种和质粒

2.2.3化学试剂

2.2.4工具酶

2.2.5常用储存液

2.2.6常用缓冲液

2.2.7常用培养基

2.2.8棉花总RNA的提取试剂

2.2.9 PCR扩增分析试剂

2.2.10转膜和Northern杂交所用试剂

2.2.11实验器材

2.3实验方法

2.3.1.GhTIP1 cDNA分离与鉴定

2.3.2基因序列分析

2.3.3棉花及烟草材料的准备

2.3.4 RT-PCR反应

2.3.5 Northern杂交

2.3.6载体构建实验方法

2.3.7酵母转化试验

2.3.8 GhTIP1表达载体的构建和烟草转化

2.3.9转基因烟草阳性苗的鉴定

2.3.10转基因烟草的耐逆性分析

2.4结果与分析

2.4.1 RNA的提取及cDNA的合成

2.4.2 GhTIP1基因的生物信息学分析

2.4.3 GhTIP1基因的组织特异性表达分析

2.4.4 GhTIP1基因在根不同发育阶段的表达模式

2.4.5 GhTIP1基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式

2.4.6转基因酵母的抗逆性分析

2.4.7 GhTIP1基因转化烟草植株

2.5讨论

第三章GhDi19基因的克隆及功能分析

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1实验材料

3.2.2 GhDi19 cDNA的筛选与分离

3.2.3基因序列分析

3.2.4 RT-PCR反应

3.2.5 Northern杂交

3.2.6棉花Genomic DNA的提取—高盐低渗法

3.2.7 Genome walker PCR方法调取启动子

3.2.8重组载体PBI101-A和PBI101-B的构建

3.2.9 PBI121-GhDi19表达载体的构建和烟草转化

3.2.10转基因烟草的鉴定

3.3结果与分析

3.3.1 GhDi19-1与GhDi19-2的序列及进化关系分析

3.3.2 GhDi19蛋白的疏水性分析

3.3.3 GhDi19的表达模式分析

3.3.4 Genome walker PCR扩增GhDi19-1和GhDi19-2的启动子

3.3.5 GhDi19表达载体的构建及烟草转化

3.4讨论

第四章低温胁迫下棉花子叶蛋白质的双向电泳分析

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1试剂的配制

4.2.2棉花材料的处理

4.2.3蛋白质的提取

4.2.4 Bradford法测蛋白含量

4.2.5双向电泳

4.2.6染色

4.2.7图像的扫描和分析

4.3结果与分析

4.3.1总蛋白的分离

4.3.2蛋白分离的重复性及其效果

4.3.3差异表达蛋白点的分析

4.4讨论

4.4.1蛋白样品的制备

4.4.2电泳的条件

4.4.3低温处理下蛋白点的差异表达

第五章结论

参考文献

博士期间发表的论文

致 谢