皮落青霉菌HS--L16脂肪酶基因克隆表达及多拷贝载体构建

摘要

脂肪酶（三酰基甘油酰基水解酶，EC3.1.1.3）作为一类可以催化长链甘油三酯水解、氨解、转酯、酯化等反应的水解酶类，在转化油脂这种水不溶性化合物的过程中扮演着重要的角色。近年来，随着酶工程技术的迅速发展，微生物脂肪酶逐渐得到了更多的关注。因为微生物脂肪酶相对于动植物脂肪酶有更大的利用价值:它具有多样化的催化活性且在生产中易获得更高的产量;微生物遗传操作更简单易行;用于生产的微生物培养基成本低且生产不受季节变化的影响;微生物脂肪酶相对于同类动植物脂肪酶更加稳定，生产过程也更加便利和安全，正因为这些优势，微生物脂肪酶在工业应用中开始发挥重要的作用。 由于本实验室分离的野生菌产脂肪酶活性较低，不适于大规模的工业生产。因此本文以实验室保藏的皮落青霉菌HS-L16脂肪酶基因lip16为出发基因，以毕赤酵母X-33为宿主菌株，构建能够高效表达lip16的基因工程菌。主要工作如下: (1)设计加有酶切位点的引物克隆HS-L16脂肪酶基因lip16，亚克隆至毕赤酵母表达载体pPICZαA，构建重组表达质粒pPICZαA-lip16。利用电击转化使目的基因整合至X-33酵母染色体中。对阳性转化子进行甲醇诱导表达，经过96h摇瓶发酵，发酵液最高脂肪酶活力达到62.42U/mL，与野生菌株HS-L16脂肪酶活性(5.88U/mL)相比，活性增加了约10倍。结果表明，利用毕赤酵母真核表达系统可以高效表达外源脂肪酶基因。 (2)为了进一步提高lip16在毕赤酵母中的表达水平，本文根据所用的表达载体pPICZαA可以进行多拷贝构建的特点，利用BamHⅠ&BglⅡ同尾酶法分别构建含有头尾相连2、4个表达框的重组表达质粒。经转化及诱导表达，阳性转化子的产酶活力得到明显的提升，其中含双拷贝目的基因表达框转化子产脂肪酶活性在96h达到121.67U/mL，相对于单拷贝提高约2倍;4拷贝产脂肪酶活性120h达到165.45U/mL，相对于单拷贝提高约2.6倍。对不同拷贝数酵母阳性转化子的荧光定量结果显示整合有多拷贝目的基因的转化子目的基因mRNA转录水平相对于目的基因拷贝数成比例的提高。结果表明在酵母染色体中整合多拷贝目的基因可以明显提高目的基因的表达水平。对阳性转化子连续5代的培养也表明多拷贝基因可以稳定的整合于酵母染色体中。为多拷贝构建在基因工程菌中的应用奠定了一定基础。

目录

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摘要

1．1微生物脂肪酶简介

1．2微生物脂肪酶结构及作用机理

1．3微生物脂肪酶的应用

1．3．1油脂化工及食品工业中的应用

1．3．2环境保护中的应用

1．3．3医学应用

1．3．4日常用品加工中的应用

1．4巴斯德毕赤酵母表达系统

1．4．1表达载体

1．4．2宿主菌

1．4．3巴斯德毕赤酵母表达系统特点

1．5多拷贝外源基因在毕赤酵母表达系统中的应用

1．5．1多拷贝基因的整合

1．5．2提高基因拷贝数方法

1．6本文的研究目的和意义

2材料与方法

2．1．2常用缓冲液

2．1．3常用分子制剂及商品化试剂盒

2．1．4培养基

2．2方法

2．2．2构建重组表达质粒

2．2．3多拷贝表达框重组表达质粒构建——同尾酶法

2．2．4目的基因毕赤酵母系统表达

2．2．5毕赤酵母诱导表达产物脂肪酶活性测定—分光光度法

2．2．6多拷贝酵母菌株目的基因mRNA转录水平检测——荧光定量PCR

3结果

3．2 HS-L16菌株脂肪酶基因lip16的酵母诱导表达

3．3多拷贝目的基因表达框重组质粒构建及表达

3．3．1含双拷贝表达框质粒构建

3．3．2含四拷贝表达框质粒构建

3．3．3多拷贝重组质粒酵母表达

3．4多拷贝菌株目的基因表达水平比较

3．5多拷贝菌株目的基因表达框整合稳定性

4分析与讨论

4．1 HS-L16脂肪酶基因毕赤酵母表达

4．2多拷贝重组质粒构建及毕赤酵母表达

小结

参考文献

硕士期间发表论文

致谢