黑曲霉脂肪酶基因优化设计、合成及其在酵母中的表达

摘要

脂肪酶(Triacylgycerol acylhydrolase, Lipase, EC3.1.1.3),是一类水解酶,广泛存在于植物种子,动物组织及微生物体中。能催化长链脂肪酸甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油。黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药及前体化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有广泛的用途。获得高效表达黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是该酶工业化生产的前提。
　　本文以毕赤酵母分泌表达能提高目的蛋白表达量为研究目标,对黑曲霉脂肪酶基因进行了优化设计、合成并在毕赤酵母中进行了表达,主要工作包括以下内容:1、根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对已有的黑曲霉脂肪酶基因lip的带信号肽序列的基因和成熟肽基因5’端的99个氨基酸进行突变,并合成突变引物。以原有的基因为模板PCR扩增得到突变基因的序列,与pPIC9K构建重组表达载体pPIC9K-lipm和pPIC9K-lipm-27,并在毕赤酵母GS115中进行分泌表达,摇瓶水平诱导酶液经SDS-PAGE检测表明有蛋白表达,但检测其酶活性较低。2、从Genbank已登录的黑曲霉脂肪酶基因(GenBank Accession No. DQ647700)出发,对lipA基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1044bp,编码一个348氨基酸的多肽,其中编码成熟肽基因序列长894bp,编码298氨基酸成熟肽。其中(G+C)％含量为55.59％,密码子第三位GC碱基含量为66.1％。按P.pastoris密码子偏爱性,密码子分析显示基因中RSCU值＜0.3的密码子数量为190个,占整个基因密码子的63.7％。对lipA基因mRNA分析表明,lipA基因mRNA折叠后最小自由能△G=-293.74kcal/mol。确定优化方案设计lipA基因,并人工合成lipAm基因。根据毕赤酵母密码子偏爱性,去除黑曲霉脂肪酶基因中酵母表达低频率密码子,替换为酵母高频密码子,获得能在毕赤酵母中高效表达的黑曲霉脂肪酶基因lipAm,并在合成基因的5’端加入EcoR I酶切位点,3’端加入Not I酶切位点,以便基因转入表达载体pPIC9K中。3、经人工合成及序列测定以后,构建了优化黑曲霉脂肪酶基因酵母表达载体pPIC9K-lipAm及pPIC9K-lipAm。经Sal I线性化后,电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经MD和MM平板筛选、PCR检测获得阳性重组酵母,实现了lipAm基因在酵母中的分泌表达。结果表明,摇瓶水平诱导120h后,其优化后的lipAm基因重组酵母酶活为优化前酶活的5倍。

目录

中文摘要

Abstract

1 前言

1.1 微生物脂肪酶

1.1.1 微生物脂肪酶概述

1.1.2 微生物脂肪酶的应用研究

1.2 用于生产生物柴油脂肪酶的研究进展

1.3 毕赤酵母表达系统的研究进展

1.3.1 P.pastoris表达系统的构成

1.3.2 P.pastoris表达系统的宿主菌

1.3.3 P.pastoris的转化方法及整合方式

1.3.4 外源基因表达质粒在P.pastoris中的表达方式

1.3.5 外源基因在P.pastoris表达系统中表达的影响因素

1.4 目的基因优化设计的策略

1.4.1 目的基因的特性

1.4.2 mRNA5’端非翻译区

1.4.3 起始密码子AUG的旁侧序列及mRNA二级结构

1.4.4 密码子的选择

1.4.5 基因剂量

1.5 本文研究的目的和意义

2 黑曲霉脂肪酶基因突变及其在毕赤酵母中的表达

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 引物设计

2.2.2 黑曲霉脂肪酶突变基因的扩增、克隆及重组表达载体的构建

2.2.3 重组黑曲霉脂肪酶在P.pastoris中的表达

2.3 讨论

3 黑曲霉脂肪酶基因(lipAm)的优化设计、合成及其表达

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 实验结果

3.2.1 黑曲霉脂肪酶lipA密码子的优化设计及引物合成

3.2.2 黑曲霉脂肪酶优化基因lipAm的合成、验证及校正

3.2.3 黑曲霉脂肪酶成熟肽基因lipAm-27的扩增

3.2.4 重组表达载体pPIC9K-lipAm及pPIC9K-lipAm-27的构建

3.2.5 重组黑曲霉脂肪酶的转化及在P.pastoris中的表达

3.3 讨论

参考文献

在校期间发表的论文、科研成果等

致谢