玉米黑粉菌cyp51基因上游启动子克隆及功能鉴定

摘要

玉米黑粉病是目前常见的严重玉米病害之一,主要由玉米黑粉菌侵害玉米穗部后引起。由于该致病菌直接危害果穗,因此发病时将导致玉米的严重减产和巨大危害,并给农业生产带来巨大的经济损失。细胞色素P450(CYP51)是目前唯一被发现广泛存在于高等动植物、真菌、酵母体内的一类具有混合功能的细胞色素P450单加氧酶系,因其在450nm波长处具有最大吸收峰而得名。真菌CYP51又称甾醇14-α-脱甲基酶(P45014DM)是细胞膜麦角甾醇生物合成过程中的一个关键酶,缺乏该酶将引起细胞膜结构被破以及功能丧失等,导致真菌最终死亡。目前农业上约1/3的杀真菌剂为CYP51抑制剂(demethylation inhibitors, DMIs)。然而,随着这类杀真菌剂的广泛使用,有关病菌对此类杀真菌剂产生抗药性的报道逐渐增加。研究表明:真菌抗药性与细胞色素P450过量表达密切相关;具有降解杀真菌剂能力的一个或多个P450基因的过量表达导致真菌产生抗药性。而启动子的增强效应是导致基因过量表达的主要因素之一。启动子核心结构主要包括TATA-box和CAAT-box,还包括GATA-1, CdxA, Dfd, Oct-1和AP-4等转录因子结合位点,具有特异性调节基因转录的功能。亦有报道指出,玉米黑粉菌是研究丝状真菌抗药性机制的重要模式生物之一。因此,研究玉米黑粉菌cyp51的上游调控序列及其抗性机理就显得十分重要。本研究克隆获得了玉米黑粉菌cyp51基因的上游启动子序列,结合生物信息学软件分析功能并通过构建重组表达载体鉴定其转录活性。研究结果主要分为以下两大部分:1.采用染色体步移技术,即根据已知玉米黑粉菌cyp51基因序列,设计3条特异性反向引物(GSP1、GSP2和GSP3),进行三轮热不对称PCR反应后克隆获得玉米黑粉菌cyp51基因5′上游调控区序列。使用生物信息学软件NNPP在线分析软件(http://www.fruitfly.org/seq.tools/promoter.html)预测cyp51基因5′-上游区的转录起始位点;TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)及MATCH(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html＃match)对转录因子数据库TRANSFAC(http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/)进行搜索,并寻找出cyp51基因上游调控区各转录因子结合位点,这为深入研究玉米黑粉菌cyp51的表达调控机制奠定了一定基础。2.构建启动子调控的绿色荧光蛋白重组质粒pET-Um-GFP和萤火虫荧光素报告基因重组质粒pGL-Um研究其启动子结构功能。重组表达质粒pET-Um-GFP转化E.coli BL21(DE3)进行高效表达(37℃,1.0mmol/L IPTG诱导36小时)。结果显示:分别在可见光和紫外光下观测,转化pET-Um-GFP的大肠杆菌菌液较转化pET-GFP的菌液发出的绿色荧光亮度更高。通过构建的重组质粒pGL-Um转染HeLa细胞后检测报告基因的转录活性。双荧光素酶报告基因检测系统对其表达情况显示,构建的pGL-Um启动子质粒转染组比pGL3-basic空质粒转染组的荧光素酶高出2.2倍,说明cyp51基因上游启动子在细胞内启动了荧光素酶基因的表达并增强表达效果。本文分析研究了玉米黑粉菌cyp51基因上游启动子序列的结构功能,为后续工作将采用突变截短技术对获得的上游序列做进一步诠释;也将为新型高效抗真菌新药的研发和筛选提供理论依据。

目录

摘要

Abstract

第一章 前言

1.1 细胞色素P450研究现状

1.1.1 细胞色素P450

1.1.2 细胞色素P450的结构功能研究

1.1.3 细胞色素P450酶系与除草剂代谢

1.2 cyp51基因研究进展

1.2.1 简述cyp51基因

1.2.2 CYP51蛋白的结构与功能研究

1.3 启动子功能研究概况

1.3.1 启动子特点

1.3.2 上游启动子元件

1.3.3 启动子克隆

1.3.4 启动子功能鉴定

1.4 本研究的目的意义

第二章 玉米黑粉菌上游启动子克隆及功能分析鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 化学试剂,工具酶与试剂盒

2.1.3 主要缓冲液

2.2 实验方法

2.2.1 基因组DNA的提取、纯化和质量鉴定

2.2.2 cyp51基因的扩增

2.2.3 染色体步移技术获得玉米黑粉菌cyp51基因上游调控序列区

2.2.4 生物信息学软件分析上游调控序列

2.2.5 重组质粒pET-Um-GFP的构建

2.2.6 重组质粒pET-Um-GFP的表白优化与检测

2.2.7 重组质粒pGL-Um的构建

2.2.8 细胞培养与重组质粒pGL-Um的转染

2.2.9 细胞抽提物的制备和荧光素酶的活性检测

2.3 结果与分析

2.3.1 玉米黑粉菌基因组DNA分离与鉴定

2.3.2 细胞色素P450基因(cyp51)5′-上游调控区序列的获得

2.3.3 P450基因cyp515′上游调控区序列的分析

2.3.4 玉米黑粉菌cyp51基因启动子报告基因的构建

2.3.5 启动子功能检测

2.4 讨论

第三章 重组真菌细胞色素P450nor2表达条件的优化

3.1 实验材料

3.1.1 菌种和质粒

3.1.2 化学试剂,工具酶与试剂盒

3.1.3 主要缓冲液

3.2 实验方法

3.2.1 重组蛋白pET-P450nor2的表达条件优化

3.2.2 重组蛋白pET-P450nor2的分离纯化

3.3 结果与讨论

3.3.1 重组蛋白pET-P450nor2的表达及条件优化

3.3.2 Ni-NTA亲和层析柱分离纯化重组蛋白pET-P450nor2

3.3.3 同源模建及功能分析

小结

参考文献

硕士期间发表论文

衷心感谢以下基金资助

致谢