黑胸散白蚁肠道内可培养的好氧与兼性厌氧共生细菌的多样性研究及共生鞭毛虫的系统发育分析

摘要

木食性白蚁是一类能高效降解木质纤维素的昆虫,其对木质纤维素等植物源食物的消化与肠道共生微生物密切相关。据研究共生微生物在白蚁食物消化和纤维素降解方面起着重要的作用,但迄今为止,人们对共生微生物在肠道内的代谢生理与作用机制却知之甚少。据报道白蚁肠道微生物的数量在109～1011细胞之间,而且种类十分丰富,推测它们在木质纤维素的消化,利用代谢物产能,生物固氮和尿酸循环等方面可能起着重要的作用。本实验以在我国长江流域广泛分布的木食性白蚁,黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis Snyder)为对象,研究了该白蚁肠道共生鞭毛虫的多样性,并通过对其肠道中可培养的好氧与兼性厌氧细菌的分离、纯化和鉴定,肠道内这部分共生菌的种群结构和分布状况进行了初步分析,探讨了细菌在共生环境中可能起到的作用和对微环境产生的影响,并对其中一株细菌进行了比较详细的分类鉴定和研究。研究黑胸散白蚁肠道中可培养共生微生物的多样性,有助于了解这些微生物在复杂的代谢过程中的作用,发现和利用新的微生物资源,为阐明共生微生物与木食性白蚁之间的共生机制,和以木质纤维素为基础的生物质能源的开发奠定了理论基础。本论文的研究主要取得了以下几个方面的进展:
　　 采用传统的平板菌落计数法,结合以16S rDNA序列为基础的系统发育学分析技术,研究了黑胸散白蚁肠道中好氧和兼性厌氧细菌的数量和种群结构。采用三种培养基从黑胸散白蚁肠道中总共分离到104株好氧和兼性厌氧菌。104株细菌根据扩增片段限制性酶切图谱分析主要分为55种ARDRA型。这55种类型的代表性菌株16S rRNA基因序列经与Genbank数据库比对分析,属于20个属。其中30.7％的细菌种类为芽孢杆菌属细菌,占绝对优势,其次是乳球菌属细菌,占20.2%,肠杆菌属细菌在三种培养基中均有发现,是分布最广泛的一类细菌。
　　 将分离菌株的16S rRNA基因序列的和Genbank数据库中已知菌株序列进行相似性比对,表明有6株菌的基因序列与已知细菌的相似性低于97%,可能是一些新属种的细菌。本论文对其中一株细菌TM-1T进行了详细的分类学研究,该株细菌的16S rRNA基因序列与异常球菌属细菌Deinococcus gobiensis DSM21396T的相似性最高为94%。系统发育分析表明TM-1T在系统进化树上与Deinococcus属其他种聚在一支,16S rRNA基因序列同源性约在87-94%之间。一些生理生化指标及细胞壁肽聚糖成分上也有明显差异,因此将TM-1T鉴定为Deinococcus属新种。
　　 采用实时荧光定量PCR技术还对分离细菌中的一株乳球菌属细菌Lactococcus sp.TSB-13以及肠道中的总细菌数进行了定量。以菌株Lactococcus sp.TSB-13的16S rDNA片段的特异性引物和总细菌的16S rDNA片段引物,结合实时荧光定量技术,确定在黑胸散白蚁肠道中细菌的数量约为2.06×105个/条,而乳球菌属Lactococcus sp.TSB-13在黑胸散白蚁肠道中的个数为110个/条,该菌株占整个菌群总量的0.05%。
　　 本研究还利用分子系统学方法结合荧光原位杂交技术,首次对黑胸散白蚁肠道内共生的鞭毛虫进行了报道。发现与黑胸散白蚁共生的锐滴虫目鞭毛虫主要有3种,分别是Pyrsonymphagrandis、Dinenympha exilis和D.parva,副基体纲的鞭毛虫有4种,主要属于Spirotriehonymphade、Triehonymphidae和Triehomonadidae三大类。虽然依据光学显微镜下的观察,并不是所有的鞭毛虫都得到了鉴定,但根据系统发育分析和荧光探针的原位杂交的结果,已经显示在黑胸散白蚁肠道内共生的鞭毛虫具有较高的多样性。