黑胸散白蚁肠道鞭毛虫共生细菌的系统发育分析

摘要

作为世界性的重要害虫之一，白蚁所产生的危害已日益引起人类的重视。在中国，白蚁分布遍及28个省市（自治区或地区），特别是淮河以南地区。其危害主要体现在对林木、果园、农田作物、房屋建筑和江河堤坝的危害上，对木结构建筑和江河堤坝的危害尤为严重。已有研究表明，木食性白蚁对木质纤维素等植物源食物的消化主要与其肠道共生微生物有关，共生微生物在其食物消化和代谢生理等方面起着重要的作用。尽管对白蚁的研究已取得不少进展，但目前为止，人们对其肠道微生物在食物消化，代谢生理等方面的作用机制却知之甚少。据研究白蚁肠道微生物的数量在109～1011细胞之间。它们在木质纤维素的消化，利用代谢物产能，生物固氮和尿酸循环等方面可能起着重要的作用。本实验以在我国广泛分布并引起严重危害的木食性白蚁，黑胸散白蚁(Reticulitermes Chinese, Snyder)为对象，研究该白蚁肠道鞭毛虫共生菌的多样性，通过对其肠道细菌多样性的分析，阐明共生菌在复杂代谢过程中所起的作用。对采取科学措施探索害虫治理新途径具有积极意义。完成的工作主要如下：
　　 1.研究了与黑胸散白蚁Reticulitermes Chinese肠道共生鞭毛虫Pyrsonymphagrandis相关的共生细菌的系统发育类型，运用显微操作技术从肠液混合物中分别分离出单一鞭毛虫P. grandis。以分离的纯种鞭毛虫为样品建立了P.grandis相关共生菌的16S rDNA基因文库。通过对这些克隆进行限制性片段长度多态性分析，酶切图谱相同的克隆视为具有相同的核糖型，选择了4个克隆测序。结果显示4个克隆分别属于滑行菌，“白蚁菌群1”，γ-紫细菌和β-紫细菌。
　　 2.研究了鞭毛虫Pyrsonympha modesta相关共生细菌的系统发育类型，从该鞭毛虫相关共生菌的16S rDNA基因文库得到8种核糖型克隆。测序结果显示8种克隆均属于螺旋体。
　　 3.研究了鞭毛虫Dinenympha exilis相关的共生细菌的系统发育类型，从该鞭毛虫相关共生菌的16S rDNA基因文库得到10种核糖型克隆，测序结果显示其中4个克隆属于螺旋体，2个克隆属于β-紫细菌，1个克隆属于α-紫细菌，另外3个克隆分别属于金黄杆菌、假单胞菌和丛毛单胞菌。
　　 4.研究了鞭毛虫Dinenympha porteri相关的共生细菌的系统发育类型，从该鞭毛虫相关共生菌的16S rDNA基因文库得到6种核糖型克隆，测序结果显示其中3个克隆中2个克隆属于螺旋体，另外1个克隆属于假单胞菌。
　　 5.研究了鞭毛虫Holomastigotes elongatum相关的共生细菌的系统发育类型，从该鞭毛虫相关共生菌的16S rDNA基因文库得到5种核糖型克隆，选择了3个克隆送去测序。测序结果显示其中2个克隆属于螺旋体，另外1个克隆属于β-紫细菌。

目录

文摘

英文文摘

1．前言

1.1 低等白蚁肠道共生鞭毛虫

1.2 鞭毛虫的共生细菌和古菌

1.3 白蚁共生微生物的代谢

1.4 本研究的目的及意义

2．实验材料

2.1 白蚁的采集和饲养

2.2 实验所用试剂和仪器

2.2.1 常用缓冲溶液及配制

2.2.2 PCR引物

2.2.3 寡核苷酸探针

2.2.4 酶及其他常规试剂

2.2.5 常用仪器

3．实验方法

3.1 鞭毛虫的显微分离

3.2 与鞭毛虫相关共生细菌的16S rDNA的扩增

3.2.1 PCR 反应体系

3.2.2 PCR 反应循环程序

3.3 鞭毛虫共生细菌16S rDNA基因文库的建立

3.4 测序与系统发育分析

3.5 荧光原位杂交

3.5.1 鞭毛虫样品的固定

3.5.2 荧光原位杂交

4．实验结果及讨论

4.1 与鞭毛虫Pyrsonympha grandis相关共生细菌的研究

4.1.1 鞭毛虫P. grandis的显微分离

4.1.2 与P. grandis相关细菌的16S rDNA的扩增

4.1.3 转化子的获得

4.1.4 RFLP分析

4.1.5 鞭毛虫P.grandis共生细菌的系统发育类型

4.2 与鞭毛虫P. modesta相关共生细菌的研究

4.2.1 鞭毛虫P.modesta的显微分离

4.2.2 与P.modesta相关细菌的16S rDNA的扩增

4.2.3 转化子的获得

4.2.4 RFLP分析

4.2.5 鞭毛虫P.modesta共生细菌的系统发育类型

4.3 与鞭毛虫Dinenympha exilis相关共生细菌的研究

4.3.1 鞭毛虫D.exilis的显微分离

4.3.2 与D.exilis相关共生细菌16S rDNA的扩增及文库构建

4.3.3 RFLP分析

4.3.4 鞭毛虫D.exilis共生细菌的系统发育类型

4.4 与鞭毛虫D.porteri相关共生细菌的研究

4.4.1 鞭毛虫D.porteri的显微分离

4.4.2 与D.porteri相关共生细菌16S rDNA的扩增与文库构建

4.4.3 RFLP分析

4.4.4 鞭毛虫D.porteri共生细菌的系统发育类型

4.5 与鞭毛虫Holomastigotes elongatum相关共生细菌的研究

4.5.1 鞭毛虫Helongatum的显微分离

4.5.2 与Helongatum相关细菌16S rDNA的扩增和文库构建

4.5.3 RFLP分析

4.5.4 鞭毛虫Helongatum共生细菌的系统发育类型

4.6 鞭毛虫共生细菌的主要系统发育类型

4.6.1 螺旋体

4.6.2 紫细菌

4.6.3 CFB门的细菌

4.6.4 “白蚁菌群1”

4.7 荧光原位杂交及DAPI染色结果

5．总结

参考文献

硕士期间发表和待发表的论文

附录 微生物生态学的研究方法

参考文献

致谢