基于纳米放大技术的电化学免疫传感器在生物标志物检测中的应用

摘要

众所周知，没有蛋白质就没有生命。人体内蛋白质浓度的改变与人的生理健康状况息息相关。其中疾病标志物是一类有关疾病特异性的生物蛋白质，其超低浓度监测对于疾病的鉴定、早期诊断以及治疗过程的监控有着至关重要的作用。因此发展一种高效灵敏的蛋白质免疫分析技术已经成为生化分析领域的一项重要研究课题。电化学免疫传感器结合了电化学传感器和免疫分析技术的优势，借助抗原抗体分子间的特异性识别作用，具有操作简便、分析时间短、灵敏度高、选择性好的特点，已成功应用于相关蛋白质的检测与疾病的早期诊断治疗。纳米科学技术的迅猛发展及其广泛应用为进一步提高电化学免疫传感器的检测灵敏度和选择性提供了新的发展思路。本论文首先合成了多种新型纳米复合物，用于抗原抗体分子的固定以及信号分子标记，并以磷化蛋白、硝化蛋白为模板蛋白，实现了对其高效灵敏检测。特别指出的是，纳米材料的有效使用，放大了免疫传感器的检测信号，有效提高了检测灵敏度，也为实际应用提供了可能。 本论文主要内容包括以下几个方面: 1.基于硅球/金纳米核壳材料与酶信号放大的电化学免疫传感器用于phospho-p53(S15)的研究 二氧化硅纳米颗粒（以下简称硅球）具有很高的比表面积，是一种良好的蛋白质分子固定载体，而金纳米具有优异的生物兼容性和吸附性，被广泛应用于免疫分析体系中。因此首先合成了分散性良好的硅/金纳米核壳材料，并在其表面共价键合辣根过氧化物酶(HRP)和phospho-p53(S15)检测抗体作为标记物，在玻碳印刷电极修饰上单壁碳纳米管/壳聚糖复合材料用于固定phospho-p53(S15)捕获抗体，利用夹心免疫原理实现了对磷化蛋白的定量检测。与目前广泛使用的酶联免疫分析法相比，构建的免疫传感器灵敏度有了显著提高并且检测结果不存在显著差异性，表明其有可能在实际检测中得到应用推广。 2.基于还原态石墨烯/纳米二氧化钛/壳聚糖复合材料的电化学免疫传感器用于磷酰化乙酰胆碱酯酶的检测研究 据文献表明，二氧化钛纳米颗粒对物质分子的含磷基团存在特异性识别作用。另外，石墨烯是一种具有高比表面积并且能够促进电子快速迁移的二维碳纳米材料，因其独特的性质已成为当前研究的热点。利用化学还原法合成的石墨烯/纳米二氧化钛/壳聚糖复合物作为基底在提高二氧化钛纳米负载量的同时也促进了电极界面的电子转移，实现了电化学信号的放大。再利用合成的金纳米棒作为载体，同时负载铁蛋白和抗乙酰胆碱酯酶抗体，夹心免疫原理实现了对磷酰化乙酰胆碱酯酶加合物的定量检测。结果表明，在最优条件下，电流响应信号与加合物的浓度成良好线性关系，线性范围为0.07nmol-1～60nmol-1，检出限为0.03nmol-1(S/N=3)。以人的血清为实际样品，进行加标回收实验，结果回收率范围为95.82％～105.6％，表明所构建的传感器在一定浓度范围内能够用于实际样品的检测。 3.基于石墨烯/金纳米材料和去铁铁蛋白标记的信号放大免疫传感器用于血浆铜蓝硝化蛋白的检测 首先利用化学还原法原位合成了石墨烯/金纳米材料，并用于修饰电极，进一步固定上硝化蛋白抗体，再以多壁碳纳米管作为载体同时负载硝化蛋白的检测抗体和去铁铁蛋白裹磷酸铅纳米材料，夹心免疫反应完成后，经过酸溶步骤即可间接检测抗原，即硝化蛋白的浓度。本实验以血浆铜蓝硝化蛋白作为模板抗原，在最优条件下，硝化蛋白浓度在10ng mL-1～5μgmL-1范围内，电流响应与该浓度呈现良好线性关系，检出限为5ng mL-1(S/N=3)。表明所构建的这种电化学免疫传感器对待测物的检测响应灵敏，分析时间短，将有可能用于临床检验。

目录

声明

摘要

第一章电化学免疫传感器简介

1．1生物传感器的原理及分类

1．2电化学免疫传感器简介

1．2．1电化学免疫传感器的原理

1．2．2电化学免疫传感器的分类

1．2．3影响电化学免疫传感器性能的因素

1．3纳米材料及其在免疫传感器领域的应用

1．3．1纳米材料概述

1．3．2几种常见纳米材料在免疫传感器领域的应用

1．4基于纳米技术的电化学免疫传感器的研究现状及前景分析

论文设计思想

参考文献

第二章基于硅球／金纳米核壳材料的电化学免疫传感器研究

2．1前言

2．2实验部分

2．2．1仪器与试剂

2．2．2 SWNTs-Zn／CHI纳米材料的合成

2．2．3硅球／金纳米核壳材料(si／AuNPs)和抗体复合物(Ab2-Si／AuNPs-HRP)的合成

2．2．4夹心免疫分析法检测phospho-p53(s15)

2．3结果与讨论

2．3．1修饰电极的表征

2．3．2硅球-金纳米核壳材料的表征

2．3．3抗体复合物HRP-Si/AuNPs-Ab2的XPS表征

2．3．4免疫传感器的电化学行为分析

2．3．5封闭行为分析

2．3．6 phospho-p53(S15)检测条件的优化

2．3．7 phospho-p53(S15)的定量检测以及干扰分析

2．3．8电化学免疫传感器的性能评价

2．4结论

参考文献

第三章超灵敏电化学免疫传感器用于OP-AChE磷化加合物的检测研究

3．1前言

3．2实验部分

3．2．1仪器与试剂

3．2．2磷酰化乙酰胆碱酯酶加合物(OP-AChE adduct)的制备

3．2．4金纳米棒(AuNRs)的合成

3．2．5铁蛋白／金纳米棒／抗乙酰胆碱酯酶抗体复合物(Ferr itin／AuNRs／Ab)的合成

3．2．6电化学免疫传感器的构建

3．3结果与讨论

3．3．2铁蛋白／金纳米棒／抗乙酰胆碱酯酶抗体复合物(Ferritin／AuNRs／Ab)的表征

3．3．3免疫传感器中的识别效能评价

3．3．4实验条件优化

3．3．5免疫传感器的电化学行为研究

3．3．6电化学免疫传感器的性能评价

3．4结论

参考文献

第四章基于碳纳米管及去铁铁蛋白标记的电化学免疫传感器在硝化蛋白检测中的应用

4．1前言

4．2实验部分

4．2．1试剂与仪器

4．2．2血浆铜蓝蛋白的硝化

4．2．5检测抗体复合物Ab2／MWNTs／ALP的合成

4．2．6电化学免疫传感器的构建

4．3结果与讨论

4．3．1石墨烯／金纳米复合材科合成机理及其表征

4．3．2磷酸铅-去铁铁蛋白(ALP)的合成机理及其表征

4．3．3传感器界面构建过程的交流阻抗表征

4．3．4实验条件优化

4．3．5免疫传感器的电化学行为

4．3．6免疫传感器的电化学性能评价

4．4结论

参考文献

附录

致谢