大肠杆菌FBPasE-GlpX的性质研究及以其为靶标的抑制剂的筛选

摘要

糖异生是由非碳水化合物产生葡萄糖一个前体的重要代谢途径，如有机酸，脂肪酸，氨基酸或甘油等。果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)是糖异生代谢途径中一个关键酶，该酶催化水解果糖1，6-二磷酸(FBP)形成果糖-6-磷酸(F6P)和磷酸盐(Pi)。产物果糖-6-磷酸是一个在各种生物合成途径的重要前体。它是果糖磷酸激酶催化糖酵解反应的逆反应，该反应为不可逆反应。
　　为了全面了解各种FBPase，我们课题组开始研究蓝藻FBPase，拟南芥FBPase和人的FBPase。人的FBPase可以做酶靶标治疗糖尿病。大肠杆菌FBPase与蓝藻FBPase同源性达到37％，因此大肠杆菌Ⅱ型FBPase-GlpX来说研究这个酶我们对了解细菌FBPsae有意义。此外可以进一步的了解高等植物，动物，蓝藻及细菌FBPase的各自的特点，它们之间的统一性和差异性包括生物化学性质，空间结构，活性空腔，结合方式，对应的抑制剂等等。此外，大肠杆菌Ⅱ型FBPase-GlpX是一种潜在的杀菌剂靶标。本文以大肠杆菌Ⅱ型FBPase-GlpX为研究对象，具体研究如下:
　　(1)按蛋白纯化方法获得纯度较高的大肠杆菌FBPase-GlpX蛋白，蛋白纯度达到95％以上，纯化后得到的蛋白大小36kDa。
　　(2)优化大肠杆菌Ⅱ型FBPase-GlpX测活条件，确定最优蛋白测活条件是:蛋白含量2.1mg/ml，Mn2+终浓度50.0μM，FBP终浓度0.5mM，缓冲液PH值8.0，反应时间5min，反应温度30℃。在此条件下测定GlpX的比活力为2.0±0.3U/mg。
　　(3)对大肠杆菌Ⅱ型FBPase-GlpX为酶靶标的抑制剂筛选的研究很少。我们首先通过理论设计获得针对该酶活性空腔的抑制剂，然后通过酶活测试分析这些化合物在酶水平上的生物活性。在这工作中，在实验室保存的23个A系列化合物、30个C系列化合物、17个D7S-D13S系列化合物、30个H系列化合物、14个S系列化合物、34个LH系列化合物、110个TQD系列化合物等200多种化合物在酶水平上进行了筛选。其中有12个化合物是抑制率80％以上，有34个抑制率50％以上的化合物。TQD系列化合物在粗筛选中抑制率80％以上。进一步研究获得这些化合物的IC50，其中TQD152，TQD151，TQD154，TQD153的抑制效果很好，IC50分别是3.40±1.83μM,3.91±1.45μM,7.18±1.84μM,7.87±1.84μM。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)

1．1．1 果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)的分类与性质

1．1．2 果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)的空间结构与功能

1．2 大肠杆菌果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)的研究背景

1．2．1 大肠杆菌果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)的分类

1．2．2 大肠杆菌果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)第二类酶GlpX的结构和生化特征

1．2．3 大肠杆菌果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)第二类酶GlpX的性质研究

1．3 本文立题思想

第二章 大肠杆菌FBPase-GlpX的蛋白质纯化及性质的研究

2．1 引言

2．2 实验原理

2．3 实验材料

2．3．1 主要仪器

2．3．2 主要试剂与材料

2．3．3 主要溶液的配制

2．4 实验方法与步骤

2．4．1 大肠杆菌FBPase-GlpX的蛋白纯化及含量测定

2．4．2 磷标准曲线绘制

2．4．3 PH值对大肠杆菌FBPase-GlpX活性的影响

2．4．4 金属离子对大肠杆菌FBPase-GlpX活性的影响

2．4．5 底物浓度对大肠杆菌FBPase-GlpX活性的影响及Km值

2．4．6 锰离子浓度对大肠杆菌FBPase-ClpX活性的影响及Ka值

2．4．7 反应时间对大肠杆菌FBPase-GlpX活性的影响

2．4．8 温度对大肠杆菌FBPase-GlpX活性的影响

2．4．9 大肠杆菌FBPase-GlpX活性测定

2．5 实验结果与讨论

2．5．1 大肠杆菌FBPase-GlpX蛋白纯度的检测及蛋白含量的测定

2．5．2 磷标准曲线

2．5．3 大肠杆菌FBPase-GlpX测活条件的摸索结果及Km值，Ka值

2．5．4 大肠杆菌FBPase-GlpX活性测定结果

2．5．5 本章小结

第三章 大肠杆菌FBPase-GlpX为靶标的抑制剂的筛选

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．3 实验方法

3．3．1 抑制剂的筛选方法

3．3．2 化合物粗筛

3．3．3 高活性化合物对大肠杆菌FBPase-GlpX的IC50的测定

3．4 结果与讨论

3．4．1 化合物粗筛

3．4．2 高活性化合物IC50测定结果

3．5 本章小结

第四章 全文总结

参考文献

在校期间发表的论文、科研成果等

致谢