烟粉虱（Bemisia tabaci）内共生菌分子变异、传毒相关groEL基因的克隆及原核表达研究

摘要

昆虫传播的植物病毒种类多、危害大.病毒虫传过程包括获毒、携毒与传毒3个阶段,是一个病毒、昆虫、植物互作的复杂过程,涉及到多种蛋白质的参与,包括病毒的衣壳蛋白(coat protein,CP)、GroEL蛋白、辅助因子(Helper component,HC)与下颚口针蛋白(underside-jaw protein)等.其中GroEL蛋白是由昆虫内共生菌产生的,对病毒进入昆虫体内起着免遭酶降解的保护作用.昆虫内共生菌分为初生内共生菌(Primary Endosymbiont)与次生内共生菌(Secondary Endosymbiont),与昆虫形成互惠共生关系,协同进化,对宿主昆虫的生长、生殖以及传播植物病害等方面具有特殊的作用,同时也是探讨生命起源与进化等生命现象的理想研究模式.烟粉虱已报道有27种生物型,其中B型烟粉虱分布广,传播植物病毒病害造成的危害大,比直接取食造成的危害要大得多,在中国属于重要的入侵生物.为了弄清烟粉虱分布广泛性、传毒多样性的原因,以及入侵中国过程中内共生菌的分子演化,从昆虫内共生菌的生物学特性、传播的病害及其研究的潜在意义等方面进行了综述,并且开展了有关烟粉虱内共生菌的研究.结合以上研究结果,深入研究烟粉虱内共生菌将有利于对烟粉虱传播与危害的控制;基因的原核表达是一个复杂的过程,优化原核表达条件,对获得高量的有益产物是一个难而必需的工作.进一步研究烟粉虱内共生菌的GroEL蛋白及其基因,将为烟粉虱传播植物病毒病的防治提供有利的帮助.该研究对烟粉虱的防治与控制、揭示昆虫的一些生命现象提供了新的思路,具有很好的科学意义.

目录

文摘

英文文摘

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缩略语表

第一章文献综述

第一节烟粉虱及其危害

1分类地位

2形态特征

3烟粉虱生活史

4起源与分布

5烟粉虱与温室白粉虱的区别

6烟粉虱寄主及为害特点

7烟粉虱的防治

第二节昆虫内共生菌研究概况

1内共生菌的特点

2内共生菌在昆虫中的分布

3内共生菌的种类

4内共生菌与宿主的关系

5消除内共生菌的方法

6烟粉虱的内共生菌

7研究内共生菌的意义

第三节与昆虫传播植物病毒相关的几种蛋白质

1昆虫的下鄂口针蛋白

2昆虫内共生菌产生的GroEL蛋白

3病毒的外壳蛋白

4病毒的辅助蛋白质成分

5病毒虫传相关蛋白研究的科学意义与展望

第四节影响基因原核表达的因素

1表达载体和外源基因中密码子的选用

2 mRNA的稳定性及一、二级结构的作用

3宿主的选择

4培养条件的控制

第五节立题背景与技术路线

1立题背景

2试验技术路线

参考文献

第二章烟粉虱与温室白粉虱[Tri al e uro de s vap orari orum(Westwood)]内共生菌的比较研究

1材料与方法

2结果与分析

2.1烟粉虱与温室白粉虱内共生菌的电子显微镜观察

2.2烟粉虱内共生菌groEL PCR扩增引物的筛选

2.3引物C与引物D对烟粉虱与温室白粉虱内共生菌groEL的扩增

2.4烟粉虱与温室白粉虱内共生菌16S rDNA的PCR扩增

2.5序列及其分析

3小结与讨论

参考文献

第三章烟粉虱内共生菌16S rDNA的变异与系统发生

1材料与方法

2结果与分析

2.1内共生菌16S rDNA的PCR扩增

2.2初生内共生菌16S rDNA的酶切结果

2.3次生内共生菌16S rDNA的酶切结果

2.4烟粉虱内共生菌16S rDNA的限制性酶切位点

2.5烟粉虱内共生菌的系统进化地位

2.6初生内共生菌16S rDNA系统进化树及其分析

2.7次生内共生菌16S rDNA系统进化树及其分析

2.8烟粉虱内共生菌16S rDNA基因的(G+C)mo1％含量分析

2.9不同有机体16S rDNA的系统进化树及其分析

3小结与讨论

参考文献

第四章烟粉虱内共生菌groEL基因的变异与系统发生

1材料与方法

2结果与分析

2.1烟粉虱内共生菌groEL的PCR扩增

2.2引物D对烟粉虱可培养细菌与内共生菌的PCR扩增

2.3克隆菌株的蓝白斑筛选

2.4单菌落培养物的PCR扩增

2.5 groEL阳性克隆质粒的鉴定

2.6内共生菌groEL基因系统进化树的建立与分析

2.7内共生菌GroEL氨基酸序列系统进化树的建立与分析

2.8内共生菌GroEL氨基酸序列的比较分析

3小结与讨论

参考文献

第五章烟粉虱内共生菌groEL基因的克隆与原核表达

1材料与方法

2结果与分析

2.1烟粉虱内共生菌传毒相关基因的克隆与蓝白斑筛选

2.2阳性克隆的PCR鉴定

2.3 PinXaGROEL菌株质粒的PCR与酶切鉴定

2.4核苷酸序列分析

2.5目的融合蛋白的表达

3小结与讨论

参考文献

第六章烟粉虱内共生菌groEL基因原核表达条件的研究

1材料与方法

2结果与分析

2.1 IPTG浓度对groEL原核表达的影响

2.2 groEL原核表达的动态

2.3接种量对groEL原核表达的影响

2.4初始pH值对groEL原核表达的影响

2.5阳离子对groEL原核表达的影响

2.6 NH4+浓度对groEL原核表达的影响

2.7葡萄糖对groEL原核表达的影响

2.8温度对groEL原核表达的影响

2.9温度与IPTG对groEL的诱导表达

3小结与讨论

参考文献

第七章主要结论与创新之处

1主要结论

2创新之处

3下一步设想

附录

附录一碱裂解法小量提取质粒DNA

附录二碱裂解法细菌总DNA小量提取

附录三培养基

附录四试剂与溶液

附录五大肠杆菌CaCl2法感受态细胞制备及转化

附录六表达菌株测序图谱

本人简历

致谢