邻苯二甲酸酯类物质残留ELISA方法的建立及试剂盒研制

摘要

邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)是目前广泛应用于工业生产的增塑剂，随着增塑剂的广泛使用，大量的PAEs暴露在环境中，对生态系统和人类健康造成巨大了的威胁。早在1995年，世界卫生组织(WHO)就宣布必须加强对PAEs物质的监控，继台湾增塑剂风波之后，对增塑剂特别是邻苯二甲酸酯类物质的分析检测的相关报道越来越多。报道过的检测方法，如荧光光度法、气相色谱法、液相色谱法、液质联用、气质联用等，虽然能够在一定水平上实现对部分PAEs的检测，但是多数样品前处理程序繁琐，灵敏度较低，不适用于实时定量的监控。因此建立一种快速简便，高灵敏度的痕量检测方法对实现PAEs实时监控具有重要的意义，酶联免疫吸附(ELISA)能够很好的解决这一问题，它省去了前处理过程，成本低，特异性强，成为检测PAEs的首选技术，而免疫分析的关键问题是制备出相应的抗体。
　　本研究主要分为两个部分。
　　第一部分主要是初步建立了DMP残留检测的ELISA方法。以四硝基邻苯二甲酸和甲醇为起始原料，合成了具有DMP特征性结构的半抗原DMAP，采用重氮法将DMAP分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联，合成了免疫原DMAP-OVA与包被原DMAP-BSA。用DMAP-OVA免疫BALB/c小鼠，经过四次免疫，断尾采血收集血清用于ELISA分析，通过间接竞争ELISA建立了DMP检测的标准曲线，标准曲线IC50达到311 ng/mL，证明血清中抗体特异性良好，能够用于DMP的检测，为后续细胞融合，杂交瘤细胞的筛选及单克隆抗体的大量制备做好了准备。
　　第二部分实验是DBP残留检测试剂盒的研制。首先复苏本实验室已制备出的DBP杂交瘤细胞株，经过三次有限稀释法克隆化筛选之后，得到一株高灵敏度高效价的细胞株，采用小鼠体内诱生腹水法，进行抗体的大量制备，抗体用辛酸-硫酸铵法纯化后，用于间接竞争ELISA条件的优化，包括封闭液的选择，竞争反应液中抗体稳定剂含量，竞争反应时间，二抗反应温度，显色体系的选择，生物素亲和素放大系统与常规ELISA的比较，并在最优条件下建立了间接竞争ELISA标准曲线，曲线回归方程y=(A-D)/[1+(x/C)B)]+D，其中A=1.11，B=0.9，C=191，D=-0.05，R2=0.9952，DBP浓度在13 ng/mL～1000 ng/mL(IC20～IC80)范围内时，DBP浓度的自然对数和抑制率之间呈现良好线性关系，最低检测下限为6.25 ng/mL。检测结果表明该DBP抗体可以满足对环境中DBP的检测，进行DBP试剂盒的生产。

目录

声明

摘要

1．绪论

1．1 PAEs的理化性质及应用

1．2 PAEs的暴露评价

1．3 PAEs检测方法

1．4 免疫分析技术

1．4．1 免疫分析技术简介

1．4．2 酶联免疫分析

1．4．3 生物素-亲和素放大酶联免疫分析

1．5 选题意义

2．DMP残留检测ELISA方法的建立

2．1 实验材料、试剂及仪器

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要溶液

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 半抗原的合成及结构鉴定

2．2．2 人工抗原的合成及鉴定

2．2．3 小鼠的免疫

2．2．4 抗血清效价的测定

2．2．5 抗血清灵敏度的测定

2．3 实验结果

2．3．1 半抗原结构的鉴定

2．3．1 人工抗原的鉴定

2．3．2 方阵滴定确定最适包被浓度和抗血清稀释倍数

2．3．3 抗血清效价测定结果

2．3．4 抗血清灵敏度的测定结果

2．4 讨论

2．4．1 人工抗原的制备及免疫原的选择

2．4．2 动物免疫对产生抗体特性的影响

2．4．3 结论

2．4．4 后续研究工作

3．环境中DBP残留检测ELISA试剂盒的研制

3．1 实验材料、试剂及仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要溶液

3．1．4 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 单克隆抗体的制备及纯化

3．2．2 ELISA检测条件的优化

3．2．3 人工抗原包被的间接竞争ELISA标准曲线的建立

3．3 实验结果

3．3．1 杂交瘤细胞的克隆化筛选

3．3．2 单克隆抗体的制备及纯化

3．3．3 间接竞争ELISA条件的优化

3．3．4 人工抗原包被的间接竞争ELISA标准曲线的建立

3．3．5 环境样品中DBP残留检测试剂盒原理及检测步骤

3．4 讨论

3．4．1 细胞的冻存与复苏

3．4．2 杂交瘤细胞的筛选

3．4．3 间接竞争ELISA注意事项

3．4．4 酶联免疫技术的改进—BA-ELISA

3．4．5 ELISA显色反应

参考文献

附录一

附录二

致谢