黑胸散白蚁肠道微生物的宏基因组学研究以及一种β--葡萄糖苷酶的特性研究

摘要

木食性白蚁肠道微生物在纤维素降解过程中起着非常重要的作用，但是这些肠道微生物绝大多数具有不可培养性，因此人们对它们在纤维素降解过程中所起的作用知之甚少。高通量测序技术的出现，极大地丰富了对这些难培养微生物的了解。本文以黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis Snyder)为材料，对其肠液中自由生活的细菌进行了宏基因组测序并对测序结果进行了详细分析，获得了黑胸散白蚁肠道中共生细菌各种代谢相关基因的信息，了解了优势菌群、纤维酶种类、丰度以及其他的功能基因如固氮酶基因的多样性。为进一步阐明黑胸散白蚁肠道中共生细菌的生理作用与功能奠定了基础。本论文研究的主要进展如下: 1、通过对黑胸散白蚁肠道共生细菌的宏基因组测序，共获得35，943，166reads，对ORFs的物种注释结果表明，其中所占比例最多的为螺旋体门，随后依次为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门等。KEGG功能分析表明，与环境信息加工（膜运输）有关的ORFs最多，随后依次为碳水化合物代谢、遗传信息加工（复制、转录和修复）、氨基酸代谢和核酸代谢。KEGG注释结果表明，1590个糖基水解酶基因分属于80个不同的糖基水解酶家族。还有75个未明确归类的糖基水解酶基因。在这些糖基水解酶基因中β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)有49个，分属于不同的糖基水解酶家族，其中GHF3所占比例较多。其中内切葡聚糖酶(endoglucanase)基因较少，只有8个。除此之外，还有许多与糖基水解酶相关蛋白的基因，包括分属于32个家族的纤维素结合结构域(CBM)基因703个，10个家族的多糖裂解酶(PL)基因42个，12个家族的碳水化合物酯酶(CE)基因256个，31个家族的糖基转移酶(GT)基因1636个。 2、黑胸散白蚁的共生细菌中除存在大量的糖基水解酶基因外，还存在许多其他的功能基因如固氮酶基因。在其中发现的固氮酶基因中编码钼铁蛋白α链的nifD基因12个，编码钼铁蛋白β链的nifK基因16个，编码铁蛋白的基因nifH7个。除了组成固氮酶的编码基因之外，还有与固氮作用相关的蛋白nifB基因12个、nifU基因11个。 3、对一种来自共生细菌的属于GHF3的β-葡萄糖苷酶（命名RcBG3）进行了原核表达，并以pNPG作为底物测定了该β-葡萄糖苷酶活性。研究表明，该酶最适反应温度为35℃，最适反应pH为5.2，最适反应时间为10min。在最适反应条件下该酶的酶活为58.447±0.832U/mg蛋白。RcBG3在25℃-45℃之间其活性能保持最大酶活的85％以上，但是不耐高温，在温度超过50℃之后，其酶活急剧下降，温度升高到55℃时，几乎完全失活。RcBG3具有较宽的pH范围，在pH3.2-8.0范围内都具有较高的活性，酶活均保持在最大酶活的60％以上。

目录

声明

摘要

1．1引言

1．2降解木质纤维素的酶类

1．3白蚁及其肠道共生微生物

1．3．1白蚁的分类

1．3．2白蚁肠道内的共生细菌

1．3．3白蚁肠道内的鞭毛虫

1．4研究目的和意义

2．实验材料

2．1黑胸散白蚁的采集与饲养

2．2培养基

2．3常用的溶液及试剂

2．4其他常用的试剂

2．5实验仪器设备

3．1黑胸散白蚁肠道解剖

3．2黑胸散白蚁肠道共生细菌的分离

3．3肠道共生细菌DNA的提取

3．4质粒的提取方法

3．5 β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达

3．7 β-葡萄糖苷酶(RcBG3)酶学特性研究

3．7．1葡萄糖标准曲线及回归方程

3．7．2样品蛋白质浓度的测定

3．7．3争葡萄糖苷酶活性检测

4．实验结果

4．1黑胸散白蚁肠道共生细菌的宏基因组测序及分析

4．1．1肠道共生细菌DNA的制备

4．1．2宏基因组测序结果

4．1．3宏基因组数据的功能注释

4．1．4宏基因组数据的物种注释

4．1．5共生细菌中糖基水解酶及相关蛋白基因多样性分析

4．1．6共生细菌中的固氮酶基因

4．1．7 β-葡萄糖苷酶基因序列分析

4．2一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶特性研究

4．2．1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达

4．2．2 β-葡萄糖苷酶RcBG3的特性研究

5．讨论

参考文献

致谢