核酸对铜锌超氧化物歧化酶聚集的调控作用

摘要

肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)是神经退行性疾病之一，研究发现它与错误折叠的SOD1聚集有关，其聚集形成的寡聚体和可溶低聚物被推测为细胞毒性物种。SOD1自身的或由外界环境引起的结构和性质的改变可能是导致SOD1聚集的主要原因，结合本课题组研究基础，本论文研究了不同序列的DNA与wtSOD1相互作用和聚集过程，促进SOD1形成不同形貌的聚集体，并探讨了SOD1形成的聚集体类型与细胞毒性之间的关系。本文主要通过等温量热滴定法、圆二色谱法、ANS荧光光谱、紫外吸收光谱、直角光散射法、倒置荧光显微镜、透射电镜及MTT法细胞毒性等实验，研究DNA与SOD1相互作用，取得结果如下: (1)等温量热滴定实验显示，各种序列的DNA与SOD1相互作用都是焓驱动的放热过程，主要通过静电相互作用结合，并且熵变不同。 (2)通过圆二色光谱实验可见，不同的DNA与SOD1相互作用，DNA二级结构不发生改变。ANS荧光实验表明，加入DNA使SOD1疏水残基进一步暴露，并随DNA浓度增加呈正相关，不同DNA使SOD1疏水残基暴露程度分为两组，Poly(dC)12、Poly(dG)12明显大于Poly(dA)12、Poly(dT)12，四链体[P1]、[P2]、[d(TG4T)]4明显大于相对应的ss DNA，特征峰出现了蓝移，说明加入DNA使SOD1构象进一步变化。 (3)直角光散射实验发现，不同DNA促进SOD1聚集反应快速达到平衡，形成的聚集体粒径大小也不同，分列两组，SOD1与Poly(dC)12、Poly(dG)12聚集体粒径明显大于Poly(dA)12、Poly(dT)12，当浓度增加，聚集体粒径随之增大。 (4)倒置荧光显微镜实验可见，Poly(dA)12、Poly(dT)12促使SOD1形成的聚集体荧光强度要弱于Poly(dC)12、Poly(dG)12形成的聚集体。透射电镜法可看到纳米级的聚集体形貌，前者主要形成了无定形聚集体，后者主要形成了纤维状的聚集体。而CR紫外吸收实验也表明，四链体[P1]、[P2]、[d(TG4T)]4促使SOD1形成的聚集体淀粉样纤维结构要多于对应的ss DNA。 (5)MTT法细胞毒性实验发现，加入Poly(dA)12、Poly(dT)12、ss[P1]、ss[P2]、ss[d(TG4T)]4形成的无定形聚集体培养的细胞成活率明显低于加入Poly(dC)12、Poly(dG)12、四链体[P1]、[P2]、[d(TG4T)]4形成的纤维状聚集体，从实验数据探讨聚集体类型与细胞毒性之间的关系。

目录

声明

摘要

本论文主要创新点

主要缩写词表

第一章绪论

1．1铜锌超氧化物歧化酶

1．2蛋白质构象病ALS

1．2．1蛋白质构象病

1．3 SOD1错误折叠、聚集毒性模型

1．4突变导致SOD1性质改变

1．5核酸的相关研究

1．6核酸与蛋白质相互作用聚集研究

1．6．1核酸与SOD1的聚集研究

1．6．2核酸与其他蛋白质聚集研究

1．7本论文研究内容

第二章酸性条件，不同序列DNA促进wtSOD1聚集研究

2．1引言

2．2实验材料与方法

2．2．1试剂与仪器

2．2．2溶液配制

2．2．3不同序列DNA促进SOD1聚集

2．2．5 ANS荧光法研究SOD1疏水性变化

2．2．6圆二色谱法研究二级结构

2．2．7直角光散射法研究聚集时间过程

2．2．8倒置荧光显微镜法研究聚集体形貌

2．2．9 TEM法观测聚集体形貌

2．3实验结果与讨论

2．3．1酸性条件下，不同序列的DNA与SOD1合相互作用

2．3．2酸性条件下，圆二色谱法研究二级结构变化

2．3．3酸性条件下，SOD1疏水性变化研究

2．3．4酸性条件下，SOD1自聚集研究

2．3．5酸性条件下，聚集时间过程研究

2．3．6 SOD1-DNA聚集体形貌变化研究

2．3．7不同序列的DNA与SOD1聚集机理探究

2．4本章小结

第三章酸性条件，不同结构的DNA促进wtSOD1聚集研究

3．1引言

3．2实验材料与方法

3．2．1试剂与仪器

3．2．2溶液配制

3．2．3不同结构的DNA促进SOD1聚集

3．2．4等温量热滴定法研究DNA与SOD1的结合

3．2．5圆二色谱法研究二级结构变化

3．2．8刚果红染料法研究聚集体结构

3．3实验结果与讨论

3．3．1酸性条件下，不同结构的DNA与SOD1结合相互作用

3．3．2酸性条件下，圆二色谱法研究二级结构变化

3．3．3酸性条件下，SOD1疏水性变化研究

3．3．4酸性条件下，聚集时间过程研究

3．3．5酸性条件下，CR紫外吸收法研究聚集体形貌

3．4本章小结

4．1引言

4．2实验材料与方法

4．2．1试剂与仪器

4．2．2溶液配制

4．2．3细胞毒性实验

4．3实验结果与讨论

4．3．1 Poly(dN)12-SOD1聚集体对Hela细胞的毒性

4．3．2 Poly(dN)12-SOD1聚集体对SH-SY5Y神经元细胞的毒性

4．3．3不同结构的DNA和SOD1形成的聚集体对Hela细胞的毒性

4．3．4聚集体类型与细胞毒性关系探究

4．4本章小结

结论与展望

参考文献

致谢