邻苯二甲酸单甲酯单克隆抗体的制备及试剂盒的研制

摘要

邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)是聚氯乙烯等塑料制品的增塑剂成分，同时它还是纺织纤维类润滑剂及胶粘合剂的重要工业原料。随着现代工业的发展，塑料制品的用途日益广泛，塑料、纺织纤维和粘合剂等这些材料又是我们日常生活中的常见日用品，因此，PAEs在现代生活中随处可见。由于PAEs具有很难被分解和累积效应的特点而通过食物链和水循环而进入环境中。台湾的增塑剂风波使得更多的人们非常关注PAEs。研究发现，PAEs为环境内分泌干扰物，具有生殖毒性、致癌、致畸等遗传毒性，因而各国均加强了对该物质的检测力度。
　　目前，PAEs常用的检测方法有液相色谱法、气相色谱法、液质联用、气质联用等，这些方法均能在一定浓度范围内实现对PAEs的检测，但是使用上述这些方法进行检测时大多要对样品进行处理，且检测的过程复杂，费时费事，成本较高，灵敏度较低。因此，建立一种省时省力、成本较低的检测方法迫在眉睫。
　　酶联免疫吸附(ELISA)检测具有对检测样品的专一性，同时样品处理过程较为简单，检测成本较低，可以一次性检测多个样品，且灵敏度高。因此，酶联免疫吸附(ELISA)能很好地解决上述物理、化学检测中存在的这些问题，但是ELISA检测的关键问题是首先要有PAEs相应的抗体。
　　邻苯二甲酸单甲酯(MMP)是PAEs中的一种，为建立MMP的ELISA检测方法，本研究以4-硝基邻苯二甲酸酐和甲醇为原料合成4-氨基邻苯二甲酸单甲酯，即半抗原，通过化学偶联方法将半抗原分别连接载体蛋白OVA和BSA，得到人工抗原MMAP-OVA，MMAP-BSA，MMCP-OVA，MMCP-BSA。将人工抗原对小鼠进行免疫，同时进行效价及抑制率的测定，通过细胞融合的方法制备杂交瘤细胞，对融合细胞进行筛选及克隆化，建立MMP单克隆细胞株，制备MMP单克隆抗体并利用该抗体进行试剂盒的研制。
　　研究结果表明:通过采用紫外光谱法和SDS-PAGE法鉴定人工抗原的合成时成功的。在第五次免疫后对小鼠的血清进行测定，测得MMCP-BSA组小鼠的效价均达到了105以上，达到了免疫的要求。对该组小鼠的血清采用间接竞争ELISA法测得IC50为115μg/L。以上结果显示小鼠免疫效果良好，符合细胞融合的要求。通过细胞融合和对杂交瘤细胞的筛选试验获得一株能稳定分泌抗体的细胞株。对该细胞株进行染色体分析得到其染色体条数为97～103条，证明该融合是成功的。对该抗体进行性质鉴定测得其蛋白质含量为3.75 mg/mL。在抗体制备成功的基础上进行试剂盒的制备，采用间接竞争法测得当MMP浓度在10.43～264.72μg/L时y=0.1646Inx-0.1669，R2=0.9902，性关系良好，最低检测浓度为3.9μg/L。该结果显示该抗体可以满足MMP的痕量检测。
　　本研究制备出了MMP的单克隆抗体，建立了ELISA对MMP的检测方法，并利用所制的的单克隆抗体研制了检测MMP的试剂盒。该试剂盒的研制成功能很好的对环境和代谢中所残留的MMP进行大量快速检测。

目录

声明

摘要

1．绪论

1．1 环境内分泌干扰物

1．1．1 环境内分泌干扰物介绍

1．1．2 环境内分泌干扰物分类

1．1．3 环境内分泌干扰物暴露途径

1．1．4 环境内分泌干扰物的主要特点

1．2 PAEs的理化性质及其应用

1．3 PAEs的暴露评价

1．4 PAEs的代谢状况

1．5 PAEs的毒性作用

1．5．1 遗传毒性

1．5．2 生殖发育毒性

1．6 PAEs的检测方法

1．6．1 色谱法

1．6．2 免疫分析法

1．6．3 生物素-亲和素放大酶联免疫分析

1．7 选题意义

2．实验材料、仪器、试剂、方法

2．1 实验材料、试剂、仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要溶液

2．1．4 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 半抗原的合成和结构鉴定

2．2．2 人工抗原的合成及鉴定

2．2．3 小鼠的免疫

2．2．4 抗血清效价的测定

2．2．5 抗血清灵敏度的测定

2．2．6 单克隆抗体的制备

2．2．7 杂交瘤细胞的检测

2．2．8 杂交癌细胞的克隆化

2．2．9 杂交癌细胞的扩大培养

2．2．10．杂交瘤细胞的染色体分析

2．2．11 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性检测

2．2．12 单克隆抗体性质鉴定

2．2．13 单克隆抗体试剂盒的研制

3．实验结果

3．1 半抗原4-氨基邻苯二甲酸单甲酯的结构鉴定

3．1．1 H1NMR鉴定

3．1．2 质谱仪鉴定

3．2 人工抗原的鉴定

3．2．1 紫外光谱扫描结果

3．2．2 SDS-PAGE鉴定

3．3 方阵滴定结果

3．4 抗血清效价测定结果

3．5 抗血清灵敏度的测定结果

3．6 细胞融合

3．7 杂交瘤细胞的筛选与克隆化

3．8 杂交瘤细胞的染色体分析

3．9 杂交瘤细胞分泌的抗体稳定性检测

3．10 单克隆抗体性质鉴定

3．11 MMP单克隆抗体试剂盒制备

3．11．1 间接竞争ELISA法检测MMP

3．11．2 使用MMP试剂检测盒对样品检测的原理及步骤

4．讨论

4．1 人工抗原的制备及免疫原的选择

4．2 免疫方案

4．3 骨髓瘤细胞的制备

4．4 杂交瘤细胞的培养

4．5 杂交瘤细胞的筛选

4．6 细胞的冻存与复苏

4．7 间接竞争ELISA注意事项

5．结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录一 主要英文缩写词

附录二 攻读学位期间论文发表情况

致谢