酸性植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

摘要

植酸酶是一种新型的可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂,是一种能水解植酸的磷酸酶类.在动物饲料中富含磷的谷物、豆类和油料等作物中,磷的基本贮存形式是植酸磷,因单胃动物体内缺少能分解植酸的酶很难利用这些植酸中的磷,其利用率极低.植酸酶对提高饲料中磷的利用率以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境污染有很大的作用.植酸酶主要来自于植物和微生物,来源于植物的植酸酶均属于6-植酸酶,最适pH范围在5.0-7.5,不适合在单胃动物中起作用的,而且在植物中含量极低,因此植酸酶的研究方向转向最适pH值为酸性、酶含量较高的丝状真菌.该实验成功从丝状真菌中提取出总DNA,通过PCR扩增,将此酸性植酸酶全基因通过pPIC9K vector转化酵母细胞,提取酵母转化子基因组进行PCR验证,结果表明外源基因整合到了酵母的染色体上.提取未降解的、不含DNA与其他杂质的RNA是进行分子克隆和基因表达分析等研究的基础.由于复杂的细胞壁和内源酶活性的存在,所以要从丝状真菌中提取和纯化出有生物活性的RNA比较困难.为获得高质量的RNA,该实验比较了TRIZOL提总RNA、异硫氰酸胍法提取菌株总RNA、热硼酸法提取菌株总RNA三种不同的提取方法,得出热硼酸法适合于富含Rnase和多糖的丝状真菌的RNA的提取,该方法可得到完整、均一的RNA样品,并且得到的RNA可用于RT-PCR等分子生物学实验操作.该实验以丝状真菌黑曲霉的总cDNA为模板,通过PCR方法扩增到理想大小的DNA片段,分别将其与质粒pBV220连接,将正确构建的重组质粒pBV220-PhyB转化大肠杆菌DH5 α,在温度诱导下,该基因在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表达产生的蛋白约60kD,表达产生的植酸酶其最适反应PH为2.5,最适反应温度为55℃.

目录

文摘

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文献综述

1植酸酶及植酸酶的研究应用

1.1植酸酶的定义及作用底物的机制

1.2植酸酶的生物学特性

1.3植酸酶基因

1.4植酸酶基因工程

1.5植酸酶的应用

1.6国内外植酸酶开发研究的现状及发展趋势

1.7植酸酶研究的发展方向

2本项研究的目的意义

2.1意义

2.2现状与问题

2.3实验目的

3酵母外源基因表达系统研究进展

3.1酿酒酵母外源基因表达系统

3.2毕赤酵母外源基因表达系统

3.3毕赤酵母表达载体

3.4整合的方式

3.5转化方法

3.6影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素及优化策略

材料与方法

1实验材料

1.1菌株与质粒

1.2培养基

1.3酶与试剂

1.4引物

1.5 RNA提取液及常用贮液

2实验方法

2.1酸性植酸酶基因在毕赤酵母中的表达

2.2丝状真菌黑曲霉总RNA的提取

2.3 RT-PCR及植酸酶基因扩增

2.4酸性植酸酶基因在大肠杆菌中的表达

实验结果

1丝状真菌总DNA的提取

2酸性植酸酶基因在毕赤酵母细胞中的表达

2.1重组质粒pPIC9K-PhyB的构建及PCR鉴定

2.2基因替换型整合转化酵母细胞

2.3基因插入型整合转化酵母细胞

3丝状真菌总RNA的提取

4酸性植酸酶基因克隆及序列测定

4.1 RT-PCR

4.2 cDNA克隆

4.3酸性植酸酶序列测定

附图

5酸性植酸酶基因在大肠杆菌中的表达

5.1重组质粒pBV220-PhyB的构建

5.2将重组质粒诱导表达

5.3表达产物酶学性质与出发菌株所产酶学性质比较研究

小结、讨论与下一步工作设想

参考文献

致谢

作者简介